Naslov
Strukturna dinamika oligomernih enzima
(Structural dynamics of oligomeric enzymes)

Autori
Lara Romac

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet Split

Mjesto
Split

Datum
15.07

Godina
2012

Stranica
61

Mentor
Orhanović, Stjepan

Ključne riječi
konformacijske promjene ; fosforescencija ; alkalna fosfataza
(conformational change ; phosphorescence ; alkaline phosphatase)

Sažetak
Jedno od temeljnih pitanja današnje enzimologije odnosi se na vezu strukture i funkcije enzima, posebno se zanimajući za način na koji se povezane kemijske i konformacijske promjene. Unutar skupine oligomernih enzima ovo pitanje je izrazito bitno i složeno. Uzimajući u obzir kako su karaktreristike enzima oblikovane i birane evolucijom, rezultati njihovog istraživanje su blisko povezani sa tumačenjem evolucijske prednosti i biološke uloge koju pojedini enzim ima. Alkalna fosfataza iz Escherichie coli dimerni je metaloenzim koji pokazuje odstupanja od Michaelis Menten kinetike koja se najbolje mogu tumačiti enzimom s nejednakim podjedinicama. Predloženi model katalitičkog ciklusa AP uključuje asimetriju enzima, nejednak afinitet podjedinica prema Mg2+ i Pi, konformacijske promjene i ulogu Mg2+ u alosteričkoj aktivaciji. Mg2+ poboljšava katalitičku efikasnost olakšavajući konformacijske promjene koje uzrokuju promjenu afiniteta podjedinica prema supstratu i produktu. U oba slučaja time je omogućeno kontrolirano otpuštanje produkta s podjedinice nižeg afiniteta, a supstrat ostavljen vezan na podjedinicu višeg afiniteta na način koji omogućava katalizu. Evolucijska prednost takvog mehanizma bila bi sprečavanje gubljenja produkta, čvršće vezanje supstrata, moguć simultan prijenos Pi i Mg2+ u stanicu, kao i mogućnost enzimskog odgovora na širok raspon koncentracija supstrata. Zbog svojih karakteristika AP bi mogla poslužiti kao modelni enzim za istraživanje potencijalnih prednosti takvog dimera nad sličnim monomernim vrstama. U prenošenju konformacijskih promjena bitnu ulogu ima sučelje podjedinica, posebno centralni β-list koji se kao istaknut strukturni detalj proteže od aktivnog mjesta do sučelja podjedinica. Točkastom mutagenezom u području â-lista na sučelju podjedinica kod T81A i T81A/G83L mutanata zamjenjene su polarne aminokiseline nepolarnima čime je onemogućeno stvaranje odgovarajućih vodikovih veza i nakon toga je ispitan njihov utjecaj na strukturu i funkciju enzima. Uzimajući u obzir važnost Zn2+, Mg2+ i Pi u strukturi i funkciji AP, svaki pojedini tip enzima, divlji tip i dva mutanta, dijaliziran je i potom rekonstituiran s navedenim ionima u omjerima 1:100, nakon čega se mjerenjem RTP i snimanjem spektara fosforescencije ispitalo kako je vezanje određenih liganda utjecalo na strukturu okoline ostatka Trp109. Kod sva tri tipa enzima nije bilo praktički nikakve razlike u τ između enzima prije dijalize i onog rekonstituiranog sa Zn2+ što ukazuje na visoku sličnost njihove strukture. Kod T81A/G83L mutanta zasićenog sa Zn2+ i Mg2+ dolazi do znatnog pada τ što ukazuje na smanjenu rigidnost okoline Trp109, odnosno na značajnu promjenu u strukturi aktivnog mjesta zbog utjecaja Mg2+ . T81A mutant je pokazao neznatno veći τ u istom slučaju, no sve njegove vrijednosti τ su jako slične te se po njima ne može detaljnije zaključiti. Kod divljeg tipa enzima najveći τ je zabilježen kod enzima rekonstituiranog sa Zn2+ i Pi pokazujući kako je vezanjem Pi okolina Trp109 postala znatno rigidnija. Kod T81A/G83L mutanta nakon pada τ kod zasićenja sa Zn2+ i Mg2+ τ također raste pri zasićenju sa Zn2+ i Pi. Mjerenje τ kod enzima prije dijalize i onog rekonstituiranog sa Zn2+ dalo je najveće rezultate za T81A/G83L mutanta što se tumači omogućenim stvaranjem hidrofobnih interakcija među uvedenim nepolarnim aminokiselinama i posljedično rigidnije struktuiranje okoline Trp109. Preklapanje spektara fosforescencije nije pokazalo značajne promjen u maksimumima apsorpcije pokazujući kako nije došlo do bitne promjene u izloženosti Trp109 polarnom otapalu. Kod mutiranih enzima promjene u rigidnosti mikrookoline Trp109 i njihov smanjen kcat pokazuju koliku važnost u strukturi i funkciji enzima ima sučelje podjedinica koje omogućuje interakcije među podjedinicama i prijenos konformacijskih promjena.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Kemija

POVEZANOST RADA