Naslov
Primjena proteinskog inženjerstva u pripravi seril-tRNA-sintetaza promijenjene strukture i funkcije
(The preparation of seryl-tRNA synthetase altered in structure and function by protein engineering)

Autori
Landeka, Irena

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, doktorska disertacija

Fakultet
Prehrambeno-biotehnološki

Mjesto
Zagreb

Datum
01.11

Godina
1999

Stranica
104

Mentor
Weygand-Đurašević, Ivana

Neposredni voditelj
Weygand-Đurašević, Ivana

Ključne riječi
seril-tRNA-sintetaza; transkripcija in vitro; tRNASer; ekspresija; proteinsko inženjerstvo; aminoacil-tRNA-sintetaze
(seryl-tRNA synthetase; in vitro transcription; tRNASer; expression; protein engineering; aminoacyl-tRNA synthetase)

Sažetak
Aminoacil-tRNA-sintetaze razreda 2 sadrže tri strukturna motiva koji se sastoje od evolucijski očuvanih sljedova aminokiselina. Motiv 1 nalazi se na dodirnoj površini između dviju podjedinica, dok su motivi 2 i 3 dio katalitičke domene. U cilju proučavanja aktivnog mjesta seril-tRNA-sintetaze kvasca Saccharomyces cerevisiae, in vitro mutagenezom promijenjene su aminokiseline u petlji motiva 2, a funkcionalnost mutanata ispitana je komplementacijom in vivo. Pokazano je da razina mutantnog proteina dobivena ekspresijom pod konstrukcijskim ADH-promotorom nije dostatna za zamjenu enzima divljeg tipa. Iznimno velika količina proteina, kao rezultat ekspresije pod kontrolom inducibilnog GAL-promotora, pokazuje vrlo slabu komplementaciju. Usporedbom s kinetičkim parametrima dobivenim u pokusima in vitro, potvrđen je gotovo potpuni gubitak aktivnosti mutiranih enzima. Time je pokazano da su promijenjene aminokiseline dio aktivnog mjesta, a odstupanje od visoko očuvane strukture dovodi do njene destabilizacije i gubitka funkcije. Seril-tRNA-sintetaza iz kvasca Saccharomyces cerevisiae, te dva mutirana oblika enzima proizvedeni su ekspresijom s jakim inducibilnim promotorom u ekspresijskim plazmidima pET3 (u bakteriji E. coli) i pCJ11 (u kvascu). Nakupljanje željenog proteina u ovakvim pojačano producirajučim sustavima znatno je pojačano (do 150 puta) u odnosu na razinu ekspresije.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biologija

POVEZANOST RADA