Naslov
Transkripcija in vitro gena za tRNASer iz arheje Methanococcus maripaludis i provjera njihove funkcionalnosti
(In vitro transcription of Methanococcus maripaludis tRNASer genes and functional analysis of the transcripts)

Autori
Jarić, Jelena

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad

Fakultet
Prirodoslovno-matematički

Mjesto
Zagreb

Datum
18.06

Godina
2002

Stranica
72

Mentor
Weygand-Đurašević, Ivana

Neposredni voditelj
Gruić-Sovulj, Ita

Ključne riječi
Methanococcus maripaludis; nekovalentni kompleks; renaturacija tRNA; SerRS; transkripcija in vitro; tRNA
(Methanococcus maripaludis; noncovalent complex; renaturation of tRNA; SerRS; transcription in vitro; tRNA)

Sažetak
Transfer ribonukleinske kiseline imaju važnu ulogu u biosintezi proteina povezujući kodone u mRNA s odgovarajućom aminokiselinom. U stanici uglavnom postoji više molekula tRNA za jednu aminokiselinu. Takve tRNA nazivaju se izoakceptori. U sklopu istraživanja strukture i funkcije seril-tRNA-sintetaza (SerRS) iz arhealnih organizama transkribirani su in vitro pomoću T7 RNA-polimeraze sintetski geni za tri izoakceptorske tRNASer (s antikodonima GCT, TGA i GGA) iz arheje Methanococcus maripaludis koji su bili pripremljeni ranije u laboratoriju i uklonirani u visokokopijske plazmide. Dobiveni in vitro-transkripti tRNASer pročišćeni su denaturirajućom poliakrilamidnom gel-elektroforezom te im je određena aktivnost aminoaciliranjem serinom pomoću SerRS iz M. maripaludis. Ispitivanjem uvjeta renaturacije in vitro-transkripata pokazano je da način renaturacije ovisi o primarnoj strukturi tRNA. Budući je in vitro-transkript tRNASerGCT imao najveću akceptorsku aktivnost, na tom se transkriptu sprovela sustavna analiza uvjeta renaturacije. Uzorci tRNA sporo su renaturirani uz dodatak različitih koncentracija Mg2+ iona na različitim temperaturama. Nanošenjem tih uzoraka na nativni poliakrilamidni gel opažene su ili dodatne vrpce tRNA, vrlo vjerojatno konformeri ili oligomeri tRNA, ili je uočena hidroliza tRNA. Samo se brza renaturacija (denaturacija 5˘ na 80 °C, dodatak 10 mmol dm-3 MgCl2 na 70 °C, hlađenje 20˘ na sobnoj temperaturi) pokazala pogodna za dobivanje homogenog uzorka tRNASerGCT. Rezultati aminoacilacijskog testa pokazali su da su molekule tRNA, koje su imale drukčiju elektroforetsku pokretljivost na nativnom poliakrilamidnom gelu, ipak odgovarajući supstrati enzima SerRS. Gel-retardacijskom elektroforezom, pri pH 7,0 i uz 10 mmol dm-3 Mg2+, detektiran je nekovalentni kompleks SerRS iz M. maripaludis i in vitro-transkripta tRNASerGCT. Nekovalentni kompleksi SerRS i tRNASerTGA te SerRS i tRNASerGGA, pri istim uvjetima, nisu detektirani.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biologija

POVEZANOST RADA