Naslov
Genetska raznolikost virusa klopnega meningoencefalitisa v Sloveniji
(Genetic Heterogeneity of the Tick-Borne Encephalitis Virus in Slovenia)

Autori
Emina, Durmiši

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, doktorska disertacija

Fakultet
Medicinska fakulteta

Mjesto
Ljubljana

Datum
11.04

Godina
2013

Stranica
147

Mentor
Avšič-Županc, Tatjana

Ključne riječi
Genetska_raznolikost ; virus_klopnega_meningoencefalitisa ;
(Genetic_Heterogeneity ; Tick-Borne_Encephalitis_Virus)

Sažetak
Virus klopnega meningoencefalitisa (KMEV) se v naravi ohranja s kroženjem med naravnimi gostitelji kot so mali sesalci in divjad, ter klopi, ki so prenašalci virusa. Pri človeku, ki je naključni gostitelj, lahko KMEV povzroči okužbo osrednjega živčevja z resnimi posledicami, kar ima pomemben vpliv na javno zdravstvo v endemičnih področjih. KMEV je flavivirus, ki ima, podobno kot ostali virusi RNA, pogoste mutacije in zaradi tega potencial za hitro evolucijo. Ker ni znano, ali se v Sloveniji pojavljajo genetske različice KMEV in katere so, je bil cilj naše raziskave ugotoviti, ali obstaja raznolikost evropskega podtipa KMEV v Sloveniji. Doktorska disertacija predstavlja prvo raziskavo, ki proučuje nukleotidna zaporedja virusa KME pridobljena neposredno iz rezervoarjev, prenašalcev in končnih gostiteljev virusa KME na enem zemljepisnem področju. Doktorsko nalogo smo razdelili na tri dele. Virusno RNA smo izolirali neposredno iz vzorcev klopov, majhnih glodavcev in vzorcev bolnikov s KME brez posrednega gojenja v celičnih kulturah ali laboratorijskih živalih. Molekularnim izolatom smo določili nukleotidno zaporedje, ki nosi zapis za beljakovini NS5 in E. Zapis za beljakovino NS5 smo izbrali, ker je beljakovina NS5 največja nestrukturna beljakovina flavivirusov. Njen zapis je najbolj ohranjen in stabilen del virusnega genoma. Ima osrednjo vlogo pri podvajanju virusne RNA. Vsebuje virusno od RNA odvisno RNA polimerazo in ima metiltransferazno aktivnost, kar je pomembno pri stabilizaciji in prevajanju molekule RNA. Sodeluje pri zaviranju imunskega odziva in je pomemben virulenčni dejavnik virusa. Zapis za beljakovino E smo izbrali, ker je beljakovina E osnovna ovojnična beljakovina virusa in je zato tudi osnovna tarča nevtralizirajočih protiteles. Odgovorna je za ključne funkcije vstopa virusa v celice, kot sta vezava na receptor in fuzija z membrano ter za indukcijo nevtralizirajočih protiteles. Zapis zanjo je dovolj dolg in kljub raznolikosti dovolj dobro ohranjen za filogenetske analize. Poleg tega je v genski bazi podatkov na voljo veliko informacij o številnih zapisih za beljakovino E, ki imajo zemljepisno različen izvor. V prvem delu raziskave smo na osmih zemljepisnih področij Slovenije, ki se delno razlikujejo v svojstvenih ekoloških pogojih, v eno-mesečnih presledkih v letih od 2005 do 2008 nabirali klope z metodo zastave. V raziskavo smo vključili 9209 klopov, ki smo jih uredili v 1192 skupin. RNA virusa KME smo dokazali v sedemindvajsetih skupinah klopov. Pomnožili smo 1075 bp dolg tarčni odsek beljakovine NS5 pri devetih od sedemindvajset pozitivnih vzorcev klopov in 931 bp dolg tarčni odsek beljakovine E pri osmih pozitivnih vzorcih klopov. Nukleotidne zapise smo uporabili v nadaljnjih filogenetskih analizah. V drugi del raziskave smo vključili glodavce, ki imajo pomembno vlogo pri enzootskem kroženju virusa KME. V raziskavo smo vključili 842 glodavcev, ki so bili ujeti z živolovkami na različnih področjih Slovenije od leta 1992 do leta 2010. RNA virusa KME smo dokazali pri sedemnajstih glodavcih. Pomnožili smo 536 bp dolg tarčni odsek beljakovine NS5 pri osmih od sedemnajst pozitivnih vzorcev glodavcev in 1203 bp dolg tarčni odsek beljakovine E pri osmih vzorcih glodavcev. Nukleotidne zapise smo uporabili v nadaljnjih filogenetskih analizah. V tretji del raziskave smo vključili 121 vzorcev bolnikov, obolelih s KME. Za nadaljnje raziskave smo izbrali 22 vzorcev, ki so zadovoljili pogojem, da so vsebovali zadostno količino materiala, da je bil rezultat RT-PCR v realnem času pozitiven, in da je bila čim večja zemljepisna razpršenost izolatov glede na naslov bivanja bolnika. Pomnožili smo 1003 bp dolg tarčni odsek beljakovine NS5 pri devetnajstih od dvaindvajset izbranih vzorcev bolnikov in 757 bp dolg tarčni odsek beljakovine E pri dvaindvajsetih vzorcih bolnikov. Nukleotidne zapise smo uporabili v nadaljnjih filogenetskih analizah. Z analizo dela genoma virusa KME smo neposredno iz klopov, glodavcev in bolnikov potrdili, da v Sloveniji kroži več genetskih različic virusa KME. Dokazali smo, da je genetska raznolikost virusa KME v Sloveniji zemljepisno razporejena, saj se genetske različice združujejo v zemljepisno ločene monofiletske linije. Opazili smo razmeroma visoko genetsko raznolikost virusa KME in določili sedem filogenetskih skupin. Dokazali smo, da je združevanje v filogenetske skupine neodvisno od gostitelja, iz katerega smo pridobili zapis za tarčna zaporedja beljakovin NS5 in E virusa KME, in da med prenašalci oziroma gostitelji na enem zemljepisnem področju prevladuje enaka genetska različica virusa KME. Pri vzorcih, pridobljenih iz klopov in glodavcev, smo dokazali povezavo med filogentskim in zemljepisnom združevanjem. Pri zapisih, pridobljenih iz bolnikov s KME, smo pridobili bolj heterogene rezultate, saj pri njih za zemljepisni izvor okužbe upoštevamo kraj stalnega bivališča, ker je dejansko mesto okužbe težko ugotoviti. Pri analizi filogenetskih dreves posameznih tarčnih odsekov za beljakovini NS5 in E smo ugotovili, da kažeta oba odseka enako filogenetsko sorodnost. Rezultati so nakazali možnost rekombinacijskega dogodka v genomu virusa KME, ki smo ga pridobili iz vzorca bolnika. Z raziskavo smo potrdili izsledke iz literature, da sta zapisa za beljakovini NS5 in E v primerjavi s celotnim genomom dobra označevalca za robustne filogenetske analize. Naša raziskava je prva, ki proučuje nukleotidna zaporedja virusa KME, pridobljena neposredno iz vzorcev prenašalca, gostitelja in končnega gostitelja na enem zemljepisnem področju.

Izvorni jezik
Slv

Znanstvena područja
Kliničke medicinske znanosti

POVEZANOST RADA