Naslov
ODREĐIVANJE PRIMARNE STRUKTURE PROTEINA
(DETERMINATION OF PROTEINE PRIMARY STRUCTURE)

Autori
Dolenec, Tajana

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
26.02

Godina
2015

Stranica
62

Mentor
Kazazić, Saša ; Galić, Nives

Ključne riječi
CID; ETD; kromatografija; spektrometrija masa
(CID; chromatography; ETD; mass spectrometry)

Sažetak
Fragmentacijske metode spektrometrije masa upotrjebljene su u analizi primarne strukture proteina kako bi se pokušalo odrediti zašto protein ne kristalizira. Eksperiment s izoelektričnim fokusiranjem pokazao je da je uzorak pročišćenog proteina smjesa tri komponente s različitim izoelektričnim točkama. MALDI TOF spektri pokazali su da je protein većim dijelom kraći od očekivanog te da postoji heterogenost u uzorku. Kako bi se odredilo gdje je protein kraći, napravljeno je triptičko cijepanje uzorka i dobivena triptička mapa je dala jasniji uvid gdje bi protein mogao biti kraći, ali ne i točno koje aminokiseline nedostaju. Zbog nejednoznačnih rezultata u eksperimentu s tripsinom provedeno je i kemijsko cijepanje cijanogen bromidom u svrhu dobivanja jednostavnije smjese s manjim brojem većih peptida. Dobiveni peptidi su dijalizirani i snimljen je MALDI TOF spektar, a izmjerene vrijednosti uspoređene s teorijskim. Na temelju dobivenih rezultata zaključeno je da je protein kraći na N-terminalnom kraju za 19 amino kiselina. Smjesa CNBr peptida je razdvojena tekućinskom kromatografijom te su prikupljene frakcije. Za sve frakcije snimljen je MALDI TOF spektar masa kako bi se ustanovilo u kojoj od njih se nalazi željeni peptid koji odgovara N- terminalnom kraju proteina. S ciljem potvrde pretpostavljene sekvence izoliranog N- terminalnog peptida otopina odgovarajuće frakcije je analizirana ESI MS/MS eksperimentom gdje je izoliran ion naboja +10 na kojem su primijenjene dvije komplementarne fragmentacijske metode. CID fragmentacija dala je mali broj b i y fragmentacijskih iona te se nije moglo sa sigurnošću tvrditi da je pretpostavljena sekvenca peptida točna. Nakon CID fragmentacije, ion peptida podvrgnut je ETD fragmentiranju pri čemu su dobiveni rezultati uspoređeni s izračunatim vrijednostima c i z fragmentacijskih iona. Broj dobivenih fragmentacijskih iona je veći nego u CID spektru. ETD metoda potvrdila je sekvencu peptida i mjesto gdje je protein skraćen.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Kemija

POVEZANOST RADA