ࡱ> d bjbjqq BFee[]B  %5EEEYYY8eLY'Jp!!!!nHpHpHpHpHpHpH$ LNHMEHEE!!I444E!E!nH4nH44zA|B!j Y1AZHI0'JBMO1`MO$BBMOEC4HH@3T'JMO :Anita Liaka*, Vlatka Rozman, Irma Kalinovi Poljoprivredni fakultet u Osijeku, Sveu iliate Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku, Kralja Petra Sva ia 1d, 31000 Osijek, Republika Hrvatska Djelovanje 1,8-cineola, kamfora i eugenola na potomstvo kestenjastog braanara - Tribolium castaneum (Herbst) Sa~etak U potrazi za alternativama u zamjenu za konvencionalne insekticide, sve eae se istra~uje u inkovitost esencijalnih ulja, ekstrahiranih iz aromati nog bilja. Kako su istra~ivanja esencijalnih ulja usmjerena na njihovu u inkovitost za suzbijanje skladianih atetnika, postavlja se pitanje jesu li u inkovita i za ni~e razvojne stadije, jednako kao i za odrasle oblike kukaca. Cilj istra~ivanja je bio istra~iti bioaktivnost 1,8-cineola, kamfora i eugenola, komponenti u sastavu eteri nih ulja aromati nih biljaka, u svrhu smanjenja potomstva kestenjastog braanara - Tribolium castaneum (Herbst), red Coleoptera, porodice Tenebrionidae. Praenje u inkovitosti na pojavu F1 generacije provedeno je testom potomstva prema metodi Jbilou et al. Trideset imaga kestenjastog braanara - T. castaneum starosti 2-4 tjedna, pomijeaanog spola stavljeno je u staklene posude volumena 350 ml ispunjene mjeaavinom paeni nog oatrog braana i suhog kvasca. Pokus je postavljen u etiri ponavljanja Tretiranje je obavljeno metodom Huang et al. Komponente 1,8-cineol, kamfor i eugenol su aplicirane u tri koncentracije (120, 300 i 600 l 350 ml-1vol.). Nakon 50 dana uzgoja u kontroliranim uvjetima, prebrojano je potomstvo, F1 generacija. Pri najni~oj koncentraciji (120 l 350 ml-1vol.), broj potomaka je bio u rasponu od 174,25 do 221,50 bez zna ajnih razlika izmeu komponenti. Pri viaoj koncentraciji (300 l 350 ml-1vol.) 1,8-cineolom je zna ajno smanjen broj potomaka u odnosu na kamfor (227,25), dok se kod eugenola broj potomaka nije zna ajno razlikovao u usporedbi s druge dvije komponente. Pri najviaoj koncentraciji (600 l 350 ml-1vol.), najmanji utjecaj na broj potomaka T. castaneum imao je kamfor (191,00) i to zna ajno manje u odnosu na 1,8-cineol (72,25) i eugenol (112,00). Izmeu 1,8-cineola i eugenola nije bilo zna ajne razlike u broju potomaka. Komponente 1,8-cineol i eugenol su djelovale na smanjenje broja potomaka, F1 generaciju kestenjastog braanara - T. castaneum, dok kamfor nije imao utjecaj na broj potomaka. Klju ne rije i: 1,8-cineol, kamfor, eugenol, potomstvo, Tribolium castaneum. Uvod Eteri na ulja su smjesa razli itih organskih spojeva. Kada biljka miruje, eteri na ulja se akumuliraju u vegetativnim organima: listovima, cvjetovima, plodovima, kori, korijenu i podancima. Razli iti dijelovi iste biljke mogu akumulirati raznovrsne tvari. Eteri na ulja koja se dobiju destilacijom ili ekstrakcijom pomou organskih otapala, predstavljaju smjese od nekoliko stotina razli itih komponenti. Do sada je dokazano viae od 3000 kemijskih spojeva kao sastavnice eteri nih ulja (Kuatrak, 2005.). No pored takvog bogatstva, samo pojedine komponente pokazuju insekticidna svojstva. Biljne aktivne komponente koje su toksi ne za kukce u obliku para su: monoterpeni, cijanohidrini i cijanati, sumporne tvari, alkaloidi te drugi. Meu njima, najveu va~nost u suzbijanju skladianih kukaca imaju monoterpeni zbog odreene fumigantne aktivnosti. U ovu skupinu spadaju i komponente 1,8-cineol, kamfor i eugenol, iju smo toksi nost ~eljeli istra~iti u ovome radu. Svaka od ovih komponenti nalazi se u sastavu eteri nog ulja viae razli itih biljnih vrsta u veoj ili manjoj koncentraciji. Tako komponenta 1,8-cineol ini najvei udio (70 - 85%) ulja eukaliptusa zastupljenog u viae od 25 vrsta eukaliptusa koje prirodno rastu u Australiji (Kuatrak, 2005.). No pored eukaliptusa, 1,8-cineol se nalazi i u sastavu ulja kadulje, lovora, ajevca, ru~marina, maj ine duaice i nekih drugih aromati nih biljaka. Kamfor je prirodni izoprenoidni bicikli ki spoj izoliran iz biljaka Cinnamonum camphora (L.). J. Presl. i Dryobalanops camphora Gaertner f. Osim toga, kamfor se nalazi u sastavu kadulje, ru~marina, lavande, lovora; dok je eugenol, kao eter cimetne kiseline, u sastavu ulja biljke klin ia - Syzygium aromaticum L. U potrazi za alternativama koje e zamijeniti konvencionalne insekticide, sve eae se istra~uju eteri na ulja ekstrahirana iz aromati nog bilja. U zadnjih 15 - 20 godina znatno je porastao interes za primjenom botani kih insekticida za suzbijanje skladianih atetnika, kao rezultat ekoloake osvijeatenosti, ali i sve vee rezistentnosti kukaca na konvencionalna kemijska sredstva. Ekoloaki aspekt se ogleda u injenici ato su biljni insekticidi, u odnosu na sinteti ke, uglavnom niske toksi nosti za sisavce te se brzo razgrauju. S druge strane, rezistentnost atetnika na konvencionalna kemijska sredstva za zaatitu uskladiatenih proizvoda postala je veliki problem u izboru kemijskih sredstava i njihove primjene u skladiatima. (Collins, 2010.). Autori Lee et. al. (2004.) testirajui rezistentnost kestenjastog braanara na 1,8-cineol, utvrdili su da ovaj braanar ne pokazuje nikakvu unakrsnu rezistentnost na komponentu 1,8-cineol (Lee et al., 2004.). Kestenjasti braanar - T. castaneum kao polifagni, kozmopolitski atetnik, naro ito je rasprostranjen u tropskim krajevima. U naaoj zemlji va~an je atetnik kao i neki drugi primjerice hrasti braanar - Cryptolestes ferrugineus Steph. ili ~itni kukulji ar - Rhyzopertha dominica F. Iako je sekundarni atetnik, jer kestenjasti braanar sposoban je oateivati ve oateena zrna, ali i zdrava zrna s vlagom viaom od 13%. Osim ~itarica, mo~e infestirati mnogo vrsta uskladiatenih proizvoda uklju ujui suncokret, uljanu poga u, braano, leguminoze, kikiriki, kavu, suho voe, kakao, okoladu, mlijeko u prahu, za ine te muzejske kolekcije herbarija (Mason, 2003.). Cilj ovoga rada bio je istra~iti utjecaj 1,8-cineola, kamfora i eugenola na potomstvo kestenjastog braanara - T. castaneum. Materijal i metode rada Komponente eteri nih ulja U istra~ivanju su upotrebljene komponente 1,8-cineol, eugenol i kamfor proizvoa a  Sigma-Aldrich (Export Division Grnwalder Weg 30 D-82041 Deisenhofen, Njema ka) i  Fluka (Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs, SG `vicarska). Eugenol i 1,8-cineol su u tekuem obliku, a kamfor u kristalnom. U svrhu dobivanja kamfora u tekuem obliku, kristalni kamfor otopljen je u 96%-tnom alkoholu u omjeru 1:1 g ml-1 (Beirevi-Laan i Jug, 2007.). Test potomstva Test potomstva proveden je po metodi Jbilou et al. (2006.). Po 30 imaga oba spola kestenjastog braanara starosti 2-4 tjedna stavljeno je u staklene posude volumena 350 ml ispunjene mjeaavinom paeni nog oatrog braana i suhog kvasca, u omjeru 10:1, s 50% ispunjenoau prostora staklenki. Komponente 1,8-cineol, kamfor i eugenol, testirane su u tri koncentracije (120, 300 i 600 l 350 ml-1vol.) u etiri ponavljanja. Komponente su aplicirane Kartell mikropipetom na filtar papir, zalijepljen na unutraanjoj strani poklopca staklenki, koje su tijekom 48 sati bile hermeti ki zatvorene i uvane u kontroliranim uvjetima na 301 C, 70 - 80% relativne vla~nosti zraka (rvz), u tami tijekom 48 sati. Nakon 48 satne izlo~enosti, izdvojena su sva imaga, uginuli su prebrojani, a preostalo braano s polo~enim jajima stavljeno je u kontrolirane uvjete na uzgoj 50 dana do pojave F1 generacije. Tijekom toga vremena staklenke su bile prekrivene mlinskom svilom kako bi se omoguio pristup zraka u staklenke. Nakon 50 dana izbrojano je potomstvo. Za usporedbu u inkovitosti 1,8-cineola i eugenola koriatena je kontrola bez aplikacije ulja, te su kontrolne staklenke uvane pri istim uvjetima (48 sati hermeti ki zatvorene, a nakon toga prekrivene mlinskom svilom kroz 50 dana) kao i testne staklenke. Za usporedbu u inkovitosti kamfora koriaten je etanol pri koncentracijama: 60, 150 i 300 l 350 ml-1vol., te je njegov utjecaj istra~ivan na isti na in kao i ostale komponente. Statisti ka obrada podataka Rezultati testa potomstva obraeni su programom SAS/STAT Software 9.1.3. (2002. - 2003.). U modulu SAS Interactive Data Analysis koriaten je Kolmogorov-Smirnov test za utvrivanje odstupanja distribucije ispitivanih varijabli od normalne distribucije. Jednosmjerna analiza varijance svih ispitivanih varijabli napravljena je u modulu SAS Analyst i koriatena je procedura ANOVA. Utvrene zna ajne razlike izmeu tretmana su ispitane Tukey's Studentized Range (HSD) testom na razini vjerojatnosti 0,05 koji se koristi u slu ajevima kada distribucija ispitivanih varijabli odstupa od normalne distribucije. Rezultati Nakon provedenog testa kojim je dobiveno potomstvo, uo en je utjecaj koriatenih komponenti na smanjenje potomstva kestenjastog braanara - T. castaneum. Izmeu komponenta (Tablica 1.) zabilje~ene su zna ajne razlike u njihovoj u inkovitosti, kao i izmeu koncentracija pojedinih komponenti. Svi pregledani uzorci potomstva, F1 generacije u stadiju imaga su bili ~ivi i normalno razvijeni bez vidljivih deformacija na pokrilju ili drugim dijelovima tijela. Tablica 1. Utjecaj 1,8-cineola, eugenola i kamfora na potomstvo Tribolium castaneum (Tukey's test, =0,05) Table 1. Influence of 1,8-cineole, eugenol and camphor on Tribolium castaneum progeny (Tukey's test, =0.05) Koncentracija l 350 ml-1 Concentration l 350 ml-1Test potomstva Progeny testKomponenta Compound1,8-cineol 1,8-cineoleEugenol EugenolKamfor Camphor EQ \x\to(X)  Std.E. EQ \x\to(X)  Std.E. EQ \x\to(X)  Std.E.120Mortalitet roditelja (%) Mortality of parents (%)0,00,0a0,830,83a0,00,0aBroj potomstva Number of progeny174,2573,93a224,2518,7a221,519,62a300Mortalitet roditelja (%) Mortality of parents (%)25,09,17a0,830,83b0,830,83bBroj potomstva Number of progeny81,014,43b132,045,82ba227,2519,4a600Mortalitet roditelja (%) Mortality of parents (%)12,51,59a0,830,83b0,00,0bBroj potomstva Number of progeny72,257,55b112,020,26b191,023,79a* srednje vrijednosti s istim slovom nemaju statisti ki zna ajne razlike za nivo P<0,05; usporedba je po redovima * means followed by the same letters are not significantly (P<0.05) different, comparison is made by row Pri najni~oj koncentraciji (120 ml-1vol.) broj potomaka kretao se u rasponu od 174,25 do 221,5, a meu komponentama nije bilo zna ajnih razlika u broju potomaka. Pri koncentraciji od 300 l 350 ml-1vol., 1,8-cineol je utjecao na zna ajno manji broj potomaka (81) u odnosu na kamfor (227,25) (F=6,16; df=2; p=0,0207), dok se kod eugenola broj potomaka nije zna ajno razlikovao od druge dvije komponente. Treba napomenuti da je kod 1,8-cineola pri ovoj koncentraciji zabilje~en zna ajno vei mortalitet tretiranih roditelja u odnosu na eugenol i kamfor (25,00%; 0,83%; 0,83% F=6,82; df=2; p=0,0158), ato je najvjerojatnije i uzrok manjeg broja potomaka kod 1,8-cineola. Pri najviaoj koncentraciji (600 l 350 ml-1vol.), 1,8-cineol i eugenol najja e su utjecali na smanjenje potomstva (72,25 i 112,00; nema statisticki zna ajne razlike) te najslabije kamfor (191,00) i to zna ajno manje u odnosu na prve dvije komponente (F=10,61; df=2; p=0,0043). Interesantno je navesti da kod 600 l 350 ml-1 vol., 1,8-cineol nije statisti ki zna ajno povisio smrtnost roditelja u odnosu na smrtnost kod 300 l 350 ml-1vol. Treba naglasiti da je mortalitet tretiranih roditelja i pri ovoj koncentraciji bio zna ajno vei kod 1,8-cineola (12,50%) u odnosu na ostale dvije komponente (0,83% - kod eugenola i 0,00% - kod kamfora) (F=45,21; df=2; p<0,0001). Stoga se manji broj potomaka kod 1,8-cineola djelomice mo~e pripisati i najveem mortalitetu roditelja, dok je kod eugenola vidljiv njegov direktan utjecaj na smanjenje broja potomaka, obzirom na zna ajno ni~i mortalitet roditelja. Tablica 2. Utjecaj 1,8-cineola i eugenola na pojavu potomstva kestenjastog braanara - Tribolium castaneum po koncentracijama (Tukey's test, =0,05) Table 2. Influence of 1,8-cineole and eugenol on Tribolium castaneum progeny by concentrations (Tukey's test, =0.05) Komponenta CompoundTest potomstva Progeny testKoncentracija (l 350 ml-1) Concentration (l 350 ml-1)Kontrola 0 Control 0120300600 EQ \x\to(X)  Std.E. EQ \x\to(X)  Std.E. EQ \x\to(X)  Std.E. EQ \x\to(X)  Std.E1,8-cineolMortalitet roditelja (%) Mortality of parents (%)0,000,00b25,009,17a12,501,59ba0,000,00bBroj potomstva Number of progeny174,2543,93ba81,0014,43b72,257,55b260,2524,75aEugenolMortalitet roditelja (%) Mortality of parents (%)0,830,83a0,830,83a0,830,83a0,000,00aBroj potomstva Number of progeny224,2518,7ba132,0045,82bXt v x    @ R b 0 F J n r P R Z\õsssggsssYghd"h3R06CJ]aJhd"hga6CJaJhd"h? 6CJaJhd"h3R06CJaJhd"h3R056\ hd"h3R056CJ\]aJhd"h 5CJ\aJhd"h3R05CJ\aJhd"h{56CJaJhb56CJaJhd"h3R06CJaJhd"h6^T0JCJaJhd"h3R0CJaJ Xt v x R b R \BD6s$da$gdga$X0d^X`0a$gdga$d<^`a$gd8 $d<^`a$gdgad^gdga$da$gd $da$gdb d<gdga \,<tvz $*>Nh.2@BBFhnõ۩۝ۑۃui[[uۑhd"h[6@CJaJhd"hga6CJaJhd"h3R06CJH*aJhd"h3R06@CJaJhd"h[6CJaJhd"h? 6CJaJhd"hEQK6CJaJhd"hK/6CJ]aJhd"hK/6CJaJhd"h$6CJaJhd"h3R06CJaJhd"hRm 6CJaJhd"hP6CJaJ#nprv~X\<@vbhjBDdl*024V󿇿}rhd"hQCJaJhd"h3R05\hd"hga6CJ]aJhd"h3R056CJ\aJhd"hga56CJ\aJhd"hga6CJaJhd"h3R06CJ]aJhd"h3R06CJH*aJhd"hP6CJaJhd"h[6CJaJhd"h3R06CJaJ, L!^!`!t!v!!!4"H"""####B$D$L$N$$$%%%%%%%&&"&$&(&*&2&4&D&F&J&L&Z&\&hd"h_CJaJhd"h_CJaJmH sH hd"h(CJaJhd"hPCJaJhd"h 1CJaJhd"hWx\CJaJhd"hVVCJaJhd"hgaCJaJhd"hK/CJaJhd"h3R0CJaJ8\&p&r&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&'''((;ͳ;ب~n]~~RRhd"h3R0CJaJ hd"h_CJOJQJ^JaJhd"h(6CJaJmH sH hd"h(CJaJmH sH hd"h(6CJaJhd"h_CJaJmH sH hd"h$CJaJhd"h(CJaJhd"hoCJaJmH sH hd"hoCJaJhd"h_CJaJhd"h_6CJaJhd"h_6CJaJmH sH  ((B(D(F(((((((()) ))))))) *:*,L-X-\-d-r---... .$.<.L.8/·¬¬¡––¬¬‹¬¬¬ƒxmamhd"hUJ6CJaJhd"hUJCJaJhd"hz 3CJaJhH'CJaJhd"hvCJaJhd"h 1CJaJhd"h(CJaJhd"h1N1R1T111111111111,24222D3Z3445$5&5>5z5555556F6hd"h3R05\nHtHhd"hYhCJaJhd"h1G}CJaJhd"h:@:^:r: < <<<==r=~=>(>>ꍀreXKhd"hQv @CJaJhd"hrn@CJaJhd"h1G}@CJaJhd"h3R0@CJH*aJhd"h3R0@CJaJhd"h1G}CJaJhd"hNFjCJaJhd"h&CJaJhd"h3R06CJaJhd"h3R05CJ\aJhd"hz 3CJaJhd"h3R0CJH*aJhd"hrnCJaJhd"h3R0CJaJhd"hJCJaJ99 <=@?HEE:JNJMiV$d<`a$gdNFj$d-DM ]a$gdNFj$d`a$gd1G}$ p#"d]"`a$gd1G}$ p#!d<]!`a$gdU$ p#!d<]!`a$gd&$d-DM ]a$gdz 3 >>>>>>>?? ?>?@?R?t?????????@@AAAAAAAAAABCCCDDDDHE~shd"h*}CJaJhd"hUCJH*aJhd"hUCJaJhd"hG CJaJhd"hQv CJaJhd"h CJaJhd"hrnCJaJhd"h3R0CJaJhd"h1G}@CJaJhd"hW@CJaJhd"h3R0@CJaJhd"hNFj@CJaJ*HEEF F"F$F,F.F(IfI:JNJ|JJJJJJKK0K`KbK~KLLLLLLMMM^NNNNN(ONOPO^OOĹĹĹĹĹīĹĹĹĹĠzhd"h!#CJ]aJhd"h{ECJ]aJhd"h{E6CJ]aJhd"h{ECJaJhd"h3R06CJ]aJhd"h\CJaJhd"h3R0CJaJhd"h3R05\nHtHhd"hWCJaJhd"hOygCJaJhd"hp 5CJaJ*MNOOOO PP#P,P$d<$Ifa$gd,$0d<x^`0a$gd{E$0d^`0a$gd{E OOOOO,P-PePfPhPiPvPwPPPPPPPPPPPPPPQQRQSQQQQQRR&S(SSS TTTT"UГГГГГГГГxhd"h1/bCJaJhd"h{ECJ]aJnHtHhd"h{ECJaJnHtHhd"h{E5CJ\aJhd"h{E6CJ]aJ#jhd"h{E6CJU]aJhd"h{ECJaJ%hd"h{E5CJH*\aJnHtH"hd"h{E5CJ\aJnHtH,,P-P.P/P:PFPNPVP]PeP$d<$Ifa$gd,kkd$$IfT4FU m"" t$6    4 49aT ePfPgPhPPPPmZZBBB$d<$7$8$H$Ifa$gd,$d<$Ifa$gd,kd$$IfT4rU m""" t$64 49aTPPPPPPPQmZZZZZZ$d<$Ifa$gd,kd$$IfT4rU m""" t$64 49aTQQ QQ*Q8QEQRQmZZZZZZ$d<$Ifa$gd,kd$$IfT4rU m"""" t$64 49aTRQSQWQpQQQQQmZZZZZZ$d<$Ifa$gd,kd$$IfT4rU m""" t$64 49aTQQQQQQQQmZZZZZZ$d<$Ifa$gd,kdu$$IfT4rU m"""" t$64 49aTQQQ$RVRlRRRmZZZZZZ$d<$Ifa$gd,kd;$$IfT4rU m""" t$64 49aTRRRRRR S&SmZZZZZZ$d<$Ifa$gd,kd$$IfT4rU m"""" t$64 49aT&S(S TT amYG4$d`a$gdoKd^`Kgd7Ld<^`Lgd{Ekd$$IfT4rU m""" t$64 49aT"U&U0U"VfVjVVVWWYYhZlZZZZZZ [[D[F[^[@\\\\\\\\\]v]z]]]__`` aһһһҰҰҰҰҚwwwwllhd"h1PCJaJhd"hvCJaJhd"hvCJH*aJhd"hCJH*aJhd"hCJaJhd"h`CJaJhd"hoCJaJhd"h\CJaJhd"h3R0CJH*aJhd"h3R0CJaJhd"haCJaJhd"h1/bCJaJhd"h1/bCJH*aJ* aaaHbVbXbbbbb4ccccddd'd(d*d+d8d9dBdCdDdQdRd[d\d]djdkdtdudvdddddd۽qqqhh{E5CJ\aJhh{E6CJ]aJ#jhh{E6CJU]aJhh{ECJaJ%hh{E5CJH*\aJnHtH"hh{E5CJ\aJnHtHhd"h!#CJ]aJhd"h{ECJ]aJhd"h{E6CJ]aJhd"h{ECJaJ( aHb4cJc\czcccd dd$d<$Ifa$gd,$0d<x^`0a$gd{E$0d^`0a$gd{E ddddd"d&d'dUBBBBBB$d<$Ifa$gd,kd$$IfTl4\oj ]o$-$B Q t044 laytT'd(d)d*d/$d<$Ifa$gd,kdv$$IfTl4ֈoj fb]o-BC$C$BQ t044 laytT*dCd\dudd$d<$Ifa$gd,$d<$7$8$H$Ifa$gd,dddd/$d<$Ifa$gd,kd $$IfTl4ֈoj fb]o-BC$C$B$Q t044 laytTdddddd$d<$Ifa$gd,dddSeTeeee8:ܴ޴"nr2ڻN(*պկxk`R`hd"h1G}6CJ]aJhd"h1G}CJaJhd"hW@CJaJhd"h1G}@CJH*aJhd"h1G}6@CJ]aJhd"h1G}@CJaJhd"h{ECJH*aJhd"h{ECJaJhd"h{ECJaJhd"h{ECJ]aJnHtHhd"h{ECJaJnHtHUhh{ECJaJhh{ECJaJnHtHddd e/$d<$Ifa$gd,kd $$IfTl4ֈoj fb]o$-B$C$C$B$Q t044 laytT ee,e9eEeSe$d<$Ifa$gd,SeTe\eue/$d<$Ifa$gd,kd $$IfTl4ֈoj fb]o-B$C$C$B$Q t044 laytTueeeeee$d<$Ifa$gd,eeee/$d<$Ifa$gd,kd $$IfTl4ֈoj fb]o$-B$C$C$B$Q t044 laytTeeee8$d<$Ifa$gd,112,0020,26b260,2524,75a* srednje vrijednosti s istim slovom nemaju statisti ki zna ajne razlike za nivo P<0,05; usporedba je po redovima * means followed by the same letters are not significantly (P<0.05) different, comparison is made by row U odnosu na kontrolu bez aplikacije ulja, 1,8-cineol je pri koncentracijama od 300 i 600 l 350 ml-1vol. zna ajno utjecao na smanjenje broja potomaka (Tablica 2.). Budui je pri 300 l 350 ml-1vol. i mortalitet roditelja bio zna ajno viai nego u kontroli (25,00%; 0,00%; F=6,6; df=3; p=0,0070), utjecaj 1,8-cineola na smanjenje potomstva nije izravan, ve je djelomice rezultat uginua tretiranih roditelja. Pri najviaoj koncentraciji se uo ava njegov ja i izravan utjecaj na broj potomaka, budui da pri ovoj koncentraciji nije bilo zna ajnih razlika u mortalitetu roditelja, a broj potomaka je opravdano ni~i u odnosu na kontrolu (72,25; 260,25 F=11,5; df=3; p=0,0009). Eugenol je imao izravan utjecaj na smanjenje broja potomaka kestenjastog braanara - T. castaneum, budui se broj uginulih roditelja nije zna ajno razlikovao, ali se zna ajno smanjio broj potomaka pri koncentracijama od 300 i 600 l 350 ml-1vol. u usporedbi s kontrolom. Kod kamfora nije zabilje~ena opravdana razlika u broju potomaka u usporedbi s kontrolom s etanolom pripadajue koncentracije (Tablica 3.), ato ukazuje da tretiranje kamforom nema utjecaj na pojavu potomstvo tretiranog imaga T. castaneum. Tablica 3. Utjecaj kamfora na pojavu potomstva kestenjastog braanara - Tribolium castaneum po koncentracijama i kontrola s etanolom (Tukey's test, =0,05) Table 3. Influence of camphor on Tribolium castaneum progeny by concentrations and control with ethanol (Tukey's test, =0.05) Komponenta CompoundMortalitet roditelja (%) Mortality of parents (%)Broj potomstva Number of progenyKoncentracija 120 l 350 ml-1 Concentration 120 l 350 ml-1 EQ \x\to(X)  Std.E. EQ \x\to(X)  Std.E.Kamfor/Camphor0,000,00a221,5019,62aKontrola1/Control12,501,59a223,2514,10aKoncentracija 300 l 350 ml-1 Concentration 300 l 350 ml-1Kamfor/Camphor0,830,83a227,2519,40aKontrola2/Control20,000,00a257,7538,79aKoncentracija 600 l 350 ml-1 Concentration 600 l 350 ml-1Kamfor/Camphor0,000,00a191,0023,79aKontrola3/Control30,000,00a224,0023,42a* srednje vrijednosti s istim slovom nemaju statisti ki zna ajne razlike za nivo P<0,05; usporedba je za svaku koncentraciju po kolonama * means followed by the same letters are not significantly (P<0.05) different, comparison is made by each concentration through the columns 1 Kontrola s etanolom koncentracije 60 l 350 ml-1 1 Control with ethanol at concentration of 60 l 350 ml-1 2 Kontrola s etanolom koncentracije 150 l 350 ml-1 2 Control with ethanol at concentration of 150 l 350 ml-1 3 Kontrola s etanolom koncentracije 300l 350 ml-1 3 Control with ethanol at concentration of 300 l 350 ml-1 Rasprava i zaklju ak U inkovitost 1,8-cineola, eugenola, ali i kamfora na smanjenje broja potomaka kestenjastog braanara - T. castaneum dokazali su i radovi stranih autora, bilo da se radilo o djelovanju jedne izdvojene komponente ili kao djelovanje eteri nog ulja sa svim svojim komponentama. Tako su Tripathi et al. (2002.) istra~ujui bioaktivnost eteri nog ulja iz liaa biljke kurkume - Curcuma longa (L.) utvrdili njegov utjecaj na pojavu potomstva kestenjastog braanara - T. castaneum, ri~inog ~iaka  Sitophilus oryze (L.) i ~itnog kukulji ara - Rhizopertha dominica (F.). Glavne sastavnice ulja kurkume su komponente mircen, p-cimen i 1,8-cineol. Broj potomaka F1 generacije imaga, koji su se razvili iz tretiranih medija, je smanjen s porastom koncentracije. Pojava potomstva sve tri testirane vrste je potpuno zaustavljena pri koncentraciji od 40,5 mg g-1 hrane. Utjecaj eteri nog ulja muakatnog oraa ia na pojavu potomstva utvrdili su i autori Huang and Ho (1998.), testirajui toksi ni i protuizjedajui u inak ulja na vrste kestenjastog braanara - T. castaneum i kukuruznog ~iaka - Sitophilus zeamais (Motsch.). Pojava potomstva je zna ajno smanjena s poveanjem koncentracije, a potpuno suzbijanje pojave potomstva je zabilje~eno pri 1,05 g 100 g-1 hrane za T. castaneum. Jedna od komponenti prisutna u sastavu eteri nog ulja testiranog za ina je i eugenol, koji je i u naaem testu utjecao na smanjeni broj potomaka T. castaneum. Komponenta 1,8-cineol je u provedenom istra~ivanju, najviae utjecala na smanjenje broja potomaka (109,08), slijedi eugenol (165) te kamfor (213,08). Treba napomenuti kako je kod 1,8-cineola zabilje~en zna ajno vei mortalitet tretiranih roditelja (pri 300 i 600 l 350 ml-1vol.) u odnosu na eugenol i kamfor, ato je djelomi no i uzrok manjeg broja potomaka kod 1,8-cineola. Eugenol je imao izravan utjecaj na smanjenje broja potomaka, budui da je zabilje~eno zna ajno manje uginue roditelja u usporedbi s 1,8-cineol. Nadalje, utvreno je da kamfor nije utjecao na smanjenje broja potomaka tretiranog imaga T. castaneum, budui da nije bilo zna ajnih razlika u odnosu na kontrolu s etanolom pripadajue koncentracije. Utjecaj kamfora na pojavu potomstva, objavili su autori Obeng-Ofori et al. (1998), apliciravai ga na zrno paenice i kukuruza. Prema njihovim rezultatima, kamfor je potpuno zaustavio razvoj jaja i li inki te razvoj potomstva S. granarius, S. zeamais, P. truncatus i T. castaneum. Ova velika razlika u u inkovitosti kamfora u odnosu na naaa istra~ivanja se djelomi no mo~e objasniti slabijim prodorom para kamfora kroz braanenu masu u odnosu kroz zrnatu masu i meuzrnate prostore. Naime upravo slabiji tlak para za difuziju i penetraciju kroz uskladiatenu robu, predstavlja jedan od nedostataka  fumiganata biljnog podrijetla da bi se okarakterizirali kao idealni fumiganti (Rajendran and Sriranjini, 2008.). Rezultati autora Rozman et al. (2008.), takoer potvruju ovu injenicu. Ispitujui utjecaj razli ito ispunjenog prostora na u inkovitost 1,8-cineola, autori su dokazali da su u praznom prostoru postignuti vrlo dobri rezultati, no u ispunjenom prostoru (50% ili 95%) zrnom paenice, 1,8-cineol je bio manje u inkovit. Tijekom naaeg istra~ivanja, dokazano je kako su komponente 1,8-cineol i eugenol zna ajno utjecale na smanjenje broja potomaka kestenjastog braanara - T. castaneum. Jedan od razloga za to, pripisuje se uginuu roditelja kod 1,8-cineola. Nadalje, kod razvijenog potomstva nisu uo ene nikakve deformacije, pa se pretpostavlja da 1,8-cineol i eugenol nisu imali utjecaj na ni~e razvojne stadije (li inke i kukuljice). Ovo saznanje otvara mogunost daljnjih istra~ivanja i detaljnijeg pojaanjenja na ina djelovanja 1,8-cineola i eugenola, kako bi se utvrdilo utje u li ove komponente na smanjeno polaganje jaja, na njihovo uginue ili pak na smrtnost tek izaalih li inki. Literatura Beirevi-La an M., Jug M., 2007. Oblikovanje lijekova, praktikum. Sveu iliate u Zagrebu, Farmaceutsko - biokemijski fakultet, Zagreb Collins P. J., 2010. Research on stored product protection in Australia: a review of past, present and future directions. Proceedings of the 10th International Working Conference on Stored Product Protection, 27 June to 2 July 2010, Estoril, Portugal, Julius-Khn-Archiv, 425, 2010 3, pp.3-13. Huang Y., Ho S. H., 1998. Toxicity and antifeedant activities against the grain storage insects, Tribolium castaneum (Herbst.) and Sitophilus zeamais Motsch. Journal of Stored Products Research 34(1): 11-17. Jbilou R., Ennabili A., Sayah F., 2006. Insecticidal activity of four medicinal plant extracts against Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae). African Journal of Biotechnology 5(10): 936-940. Kuatrak D., 2005. Farmakognozija fitofarmacija. Golden Marketing - Tehni ka knjiga, Zagreb, 2005, 219-375. Lee B. H., Annis P. C., Tumaalii F., Lee S. E., 2004. Fumigant toxicity of Eucalyptus blakelyi and Melaleuca fulgens oils and 1,8-cineol against different development stages of rice weevil Sitophilus oryzae. Phytoparasitica 32: 498-506. Mason L. J., 2003. Grain insect fact sheet E-224-W: red and confused flour beetles, Tribolium castaneum (Bhst.) and Tribolium cunfusum Duval. Purdue University, Department of Entomology. http://extension.entm.purdue.edu/publications/E-224.pdf. Rajendran S., Sriranjini V. 2008. Plant products as fumigants for stored-products insect control. Journal of Stored Products Research 44(2): 126-135. Rozman V., Koruni Z., Kalinovi I. 2008. Effect of different Quantities of wheat on the effectiveness of the essential oil cineole against stored grain insect pests. Proceedings of the 8th International Conference on Controlled Atmosphere and Fumigation in Stored Products, Chengdu, China, September 21-26, 2008: 503-506. Tripathi A. K., Prajapati V., Verma N., Bahl J. R., Bansal R. P., Khanuja S. P. S., Kumar. S., 2002. Bioactivities of the leaf essential oil of Curcuma longa (Var. Ch-66) on three species of store-product beetles (Coleoptera). Journal of Economic Entomology 95(1): 183-189. Anita Liaka*, Vlatka Rozman, Irma Kalinovi University of Josip Juraj Strossmayer in Osijek, Faculty of Agriculture in Osijek, Department for Plant protection, Kralja Petra Sva ia 1d, 31000 Osijek, Republic of Croatia Activity of 1,8-cineole, camphor and eugenol on red flour beetle Tribolium castaneum (Herbst) progeny Abstract Searching for the alternatives of the conventional insecticides, essential oils extracted from aromatic plants are notably investigated. As investigations of the essential oils are intent on their efficacy for stored pests control, there is a question if they are effective on eggs, and larvae equally as they are for the adults. The aim of this study was to test bioactivity of 1,8-cineole, camphor and eugenol, compositions of essential oils from aromatic plants, in term to mitigate progeny production in red flour beetle Tribolium castaneum (Herbst), order Coleoptera, family Tenebrionidae. Progeny test was conducted by the method of Jbilou et al. Thirty adults of red flour beetle 2-4 weeks old, mixed gender, were put into glass containers volume 350 ml filled with mixture of rough flour and dry yeast. Treatment was performed according to method of Huang et al. Compounds 1,8-cineole, camphor and eugenol were applied in three concentrations (120, 300 and 600 l 350 ml-1vol.). After 50 days of rearing in controlled conditions, adults of F1 generation have been counted. At the lowest concentration (120 l 350 ml-1vol.), number of progeny was in the range from 174.25 to 221.50 without statistic differences among tested compounds. At the higher concentration (300 l 350 ml-1vol.), 1,8-cineole significantly mitigated number of progeny with regard to camphor (227.25), while with eugenol, progeny number didn t differ significantly from the other two compounds. At the highest concentration (600 l 350 ml-1vol.), the lowest impact on appearance of progeny of T. castaneum had camphor (191.00) which was significantly lower related to 1,8-cineole (72.25) and eugenol (112.00). There wasn t any statistical differences between 1,8-cineole and eugenol in the number of progeny. Compounds 1,8-cineole and eugenol affected on mitigation of number of F1 generation of red flour beetle T. castaneum, while camphor had no impact in number of progeny. Key words: 1,8-cineole, camphor, eugenol, progeny, Tribolium castaneum. * e-mail adresa: aliska@pfos.hr * e-mail address: aliska@pfos.hr     8:/$Ld<^`La$gd{Ekd $$IfTl4ֈoj fb]o-B$C$C$B$Q t044 laytT2*`^t,$d<$Ifa$gdga$0d<x^`0a$gdNFj$0dh^`0a$gd7$d<`a$gd7$d`a$gd{E$Kd^`Ka$gd7 *drƿȿ`np^t,.flŹŭśyn[%hd"h3R05CJH*\aJnHtHhd"h3R0CJaJhd"h"5CJaJnHtH"hd"h"5CJ\aJnHtH"hd"h3R05CJ\aJnHtHhd"h0CJ]aJhd"h!#CJ]aJhd"h3R0CJ]aJh6CJ]aJhd"h3R06CJ]aJhd"h0CJaJhd"h3R0CJaJ,.0l~~~$d<$Ifa$gdgankd$$IfT94F|" t$6    44 9aT.bdtvϽπqπaqQπhd"h"CJH*aJnHtHhd"h3R0CJH*aJnHtHhd"h"CJaJnHtHhd"h3R0CJaJnHtHhd"h3R05CJ\aJhd"h3R06CJ]aJ#jhd"h3R06CJU]aJ"hd"h3R05CJ\aJnHtHhd"h3R0CJaJ"hd"h"5CJ\aJnHtH%hd"h"5CJH*\aJnHtHyy$d<$7$8$H$Ifa$gdga$d<$Ifa$gdga[kd$$IfT940 t$644 9aT0Fb~~~$d<$Ifa$gdgankd7$$IfT94F| t$6    44 9aTbd$d<$Ifa$gdgalkd$$IfT9F|""" t$6    44 9aT8l$d<$Ifa$gd"$d<$Ifa$gdgalkd$$IfT9F|""" t$6    44 9aT268:$Z^`b  $ڼqڼfZfhd"h3R0CJ]aJhd"hECJaJ"hd"h3R05CJ\aJnHtHhd"h3R0CJaJnHtHhd"h"CJH*aJnHtHhd"h"CJaJhd"h"CJaJnHtHhd"h3R0CJaJ%hd"h"5CJH*\aJnHtH"hd"h"5CJ\aJnHtH%hd"h3R05CJH*\aJnHtH"8:Xn$d<$Ifa$gdgaYkdK$$IfT90" t$644 9aTll$d<$Ifa$gdga$d<$Ifa$gd"lkd$$IfT9F|""" t$6    44 9aT$`l$d<$Ifa$gd"$d<$Ifa$gdgalkd$$IfT9F|""" t$6    44 9aT`b$d<$Ifa$gdgaYkd3$$IfT90" t$644 9aT ll$d<$Ifa$gdga$d<$Ifa$gd"lkd$$IfT9F|""" t$6    44 9aT  8^{ffffTTTKd^`Kgd7$Kd^`Ka$gd7$Ld<^`La$gd7lkd}$$IfT9F|""" t$6    44 9aT $68:<x|X\^bdDF測測桕·|qfq|qhd"h5CJaJhd"h3R0CJaJhd"h0CJaJhd"h3R05\nHtHhd"hCJH*aJhd"hCJaJhd"h"CJH*aJhd"h"CJaJhd"h3R0CJaJhd"hECJH*aJhd"h3R0CJH*aJhd"hECJaJhd"h$CJaJnHtH'"*@L8}}bb$ p#d<^`a$gdga$ p#d<7$8$H$^`a$gdga$da$gdys$d<`a$gd) $d<`a$gdys$d<`a$gd"$d-DM ]a$gd7 z"DP\^bnBP`(*R\^ 򣗋}rghd"h?CJaJhd"hZBCJaJhd"h"6CJ]aJhd"h"CJ]aJhd"h0CJ]aJhd"h3R0CJ]aJhd"h0CJaJhd"hBhlR`"@D.>~*8ӺӬhd"hWCJaJhd"hNCJaJhd"h?CJaJhd"h"6CJ]aJhd"h3R06CJ]aJhd"hysCJaJhd"hY^TCJaJhd"h7&CJaJhd"h3R0CJH*aJhd"h3R0CJaJ38>02t4tvxnpthj꺮ymbbWhd"hcCJaJhd"h) CJaJhd"hjCJ]aJ hd"hjhd"hjCJaJhd"hJ CJaJhd"h) CJ]aJhd"hZCJ]aJhd"h2CJ]aJhd"h3R06CJ]aJhd"h3R06CJaJhd"hNCJaJhd"h`CJaJhd"h3R0CJaJhd"hmKCJaJ"j:FT*@tv J`bfhǼǼDZǘDZǎ~n~^~^~ǘǘ~n~nhd"hWCJaJmHnHuhd"hysCJaJmHnHuhd"h3R0CJaJmHnHuhd"h3R05\hd"hysCJaJhd"h3R06CJ]aJhd"hNCJaJhd"hY^TCJaJhd"h3R0CJaJhd"h`CJ]aJhd"h) CJ]aJhd"hJ CJaJhd"hcCJaJ$Zxz, Jrz.R8`xx*@BJfhd"hcCJaJmHnHuhd"hjCJaJmHnHuhd"h3R06CJ]aJhd"hysCJaJhd"h3R0CJaJhd"hysCJaJmHnHu%hd"h3R06CJ]aJmHnHuhd"h3R0CJaJmHnHu5x*N|sss$d<`a$gd $da$gd d<gdga$ p#d<^`a$gdga#$d<-D7$8$H$M ^`a$gdga$ p#d<7$8$H$^`a$gdga LNPfhfh 0tv*&>RZ8>Ķ|qqffffZffhd"h3R0CJH*aJhd"hjOCJaJhd"hNCJaJhd"h3R056\]hd"hjO5\hd"h3R05\hd"h3R06CJaJhd"h6^T0JCJaJhd"h3R06CJ]aJ%hd"h3R05CJ\aJmHnHuhd"h3R00J5CJ\aJhd"h3R05CJ\aJhd"h3R0CJaJ#>l  , 2 J             2 H            ɻtnjcjnjc hE\hWhW hW0Jhd"h 6CJ]aJhd"h3R06CJaJhd"h3R056CJ\aJhd"h[CJaJhD /CJaJhd"hgaCJaJhd"h3R06CJ]aJhd"hjOCJaJ)hd"h3R00JCJaJfHq hd"h3R0CJH*aJhd"h3R0CJaJ&n2   F H L N R T X Z ^ ` b d  dgd*9gd6^T$d`a$gdb7$d<`a$gd  F H J N P T V Z \ b d hd"h3R06CJ]aJjh8)Uh8)hW @P&P"1h:pga& _7!n"#$% Dp$$If!vh5P5>5#vP#v>#v:V 4 t$6++,59/ / / / /  494T $$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6++,59/ / / /  / / / 494T $$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6++,59/ / / /  / / / 494T$$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6+,599/  / 494T$$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6+,59/  / 494T$$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6+,599/  / 494T$$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6+,59/  / 494T$$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6+,599/  / 494T$$If!vh5P5>5+5+5#vP#v>#v+#v:V 4 t$6+,59/  / 494T$$If!vh5555#v#v#v#v:V l4 t0+++,5-5B5 5Q9/ ytT$$If!vh555555#v#v#v#v#v:V l4 t0+++,5-5B5C5B5Q9/ ytT $$If!vh555555#v#v#v#v#v:V l4 t0++,5-5B5C5B5Q9/ ytT $$If!vh555555#v#v#v#v#v:V l4 t0+,5-5B5C5B5Q99/ ytT$$If!vh555555#v#v#v#v#v:V l4 t0+,5-5B5C5B5Q9/ ytT $$If!vh555555#v#v#v#v#v:V l4 t0+,5-5B5C5B5Q99/ ytT$$If!vh555555#v#v#v#v#v:V l4 t0+,5-5B5C5B5Q9/ ytT$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 94 t$6+,59/ / / /  4 9T$$If!vh5Q5#vQ#v:V 94 t$6+,5/ / / /  4 9T$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 94 t$6+,5/ / /  / / / 4 9T$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 9 t$6,59/  / 4 9T$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 9 t$6,59/  / 4 9T$$If!vh5Q5#vQ#v:V 9 t$6,59/  / / /  4 9T$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 9 t$6,59/  / 4 9T$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 9 t$6,59/  / 4 9T$$If!vh5Q5#vQ#v:V 9 t$6,59/  / / /  4 9T$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 9 t$6,59/  / 4 9T$$If!vh5Q5d 5) #vQ#vd #v) :V 9 t$6,59/  / 4 9Tb%      I2 0@P`p2( 0@P`p 0@P`p 0@P`p 0@P`p 0@P`p 0@P`p8XV~PJ_HmHnHsHtHN`N S`Normal dCJPJ_HaJmHsHtH d d ^ Z Heading 1ddd@&[$\$5CJ0KH$\aJ0mHsHtH``2` ^ Z Heading 3ddd@&[$\$5CJ\aJmHsHtHDA D Default Paragraph FontRi@R  Table Normal4 l4a (k (No List Z/Z ^ ZHeading 1 Char&5CJ0KH$PJ\^JaJ0mHsHtHV/V ^ ZHeading 3 Char"5CJPJ\^JaJmHsHtH<o< ^apple-style-span^JF/!F ^apple-converted-space^J.W 1. ^Strong 5\^J:U A: ^ Hyperlink>*B*^JphP^RP ^ Z Normal (Web)ddd[$\$PJtHP/aP ^ Zui-ncbitoggler-master-text^JVrV *9List Paragraphd^ CJPJaJX`X *9 Footnote Text dCJPJaJmHsHtHH/H *9Footnote Text Char CJ^JaJD&`D *9Footnote ReferenceH*^JfR f k:/Body Text Indent 2dx^CJaJmHsHtHV/V k:/Body Text Indent 2 CharCJPJ^JaJ2X`2 A@Emphasis 5\^JB' B PComment ReferenceCJaJD D  P Comment TextCJaJmHsHB/B PComment Text CharPJtH @j @ "PComment Subject!5\N/!N !PComment Subject Char5PJ\tH V 2V $P Balloon Text #dCJOJQJaJmHsHV/AV #PBalloon Text CharCJOJPJQJ^JaJtH PK![Content_Types].xmlj0Eжr(΢Iw},-j4 wP-t#bΙ{UTU^hd}㨫)*1P' ^W0)T9<l#$yi};~@(Hu* Dנz/0ǰ $ X3aZ,D0j~3߶b~i>3\`?/[G\!-Rk.sԻ..a濭?PK!֧6 _rels/.relsj0 }Q%v/C/}(h"O = C?hv=Ʌ%[xp{۵_Pѣ<1H0ORBdJE4b$q_6LR7`0̞O,En7Lib/SeеPK!kytheme/theme/themeManager.xml M @}w7c(EbˮCAǠҟ7՛K Y, e.|,H,lxɴIsQ}#Ր ֵ+!,^$j=GW)E+& 8PK!Ptheme/theme/theme1.xmlYOo6w toc'vuر-MniP@I}úama[إ4:lЯGRX^6؊>$ !)O^rC$y@/yH*񄴽)޵߻UDb`}"qۋJחX^)I`nEp)liV[]1M<OP6r=zgbIguSebORD۫qu gZo~ٺlAplxpT0+[}`jzAV2Fi@qv֬5\|ʜ̭NleXdsjcs7f W+Ն7`g ȘJj|h(KD- dXiJ؇(x$( :;˹! I_TS 1?E??ZBΪmU/?~xY'y5g&΋/ɋ>GMGeD3Vq%'#q$8K)fw9:ĵ x}rxwr:\TZaG*y8IjbRc|XŻǿI u3KGnD1NIBs RuK>V.EL+M2#'fi ~V vl{u8zH *:(W☕ ~JTe\O*tHGHY}KNP*ݾ˦TѼ9/#A7qZ$*c?qUnwN%Oi4 =3ڗP 1Pm \\9Mؓ2aD];Yt\[x]}Wr|]g- eW )6-rCSj id DЇAΜIqbJ#x꺃 6k#ASh&ʌt(Q%p%m&]caSl=X\P1Mh9MVdDAaVB[݈fJíP|8 քAV^f Hn- "d>znNJ ة>b&2vKyϼD:,AGm\nziÙ.uχYC6OMf3or$5NHT[XF64T,ќM0E)`#5XY`פ;%1U٥m;R>QD DcpU'&LE/pm%]8firS4d 7y\`JnίI R3U~7+׸#m qBiDi*L69mY&iHE=(K&N!V.KeLDĕ{D vEꦚdeNƟe(MN9ߜR6&3(a/DUz<{ˊYȳV)9Z[4^n5!J?Q3eBoCM m<.vpIYfZY_p[=al-Y}Nc͙ŋ4vfavl'SA8|*u{-ߟ0%M07%<ҍPK! ѐ'theme/theme/_rels/themeManager.xml.relsM 0wooӺ&݈Э5 6?$Q ,.aic21h:qm@RN;d`o7gK(M&$R(.1r'JЊT8V"AȻHu}|$b{P8g/]QAsم(#L[PK-![Content_Types].xmlPK-!֧6 +_rels/.relsPK-!kytheme/theme/themeManager.xmlPK-!Ptheme/theme/theme1.xmlPK-! ѐ' theme/theme/_rels/themeManager.xml.relsPK] ,T] AD]F \n\&(8/F6>HEO"U ad*$8j> d 356789;<>?AKLS9M,PePPQRQQQR&S ad'd*dddd eSeueee8,b8` d 4:=@BCDEFGHIJMNOPQRTUVWXYh$v$$$$$*/8/C/Q/\/j/u//O8]8h8v8]1111111118@0(  B S  ?      !defgz|%2;=?IJ'78>?HIHI!"km  f i   l n   b f C D ^ _ # $ J "#'(RV  "#%&-.89AKPRST`aijrw{  !"#&EFyz_`EF\]# []_`ab\^JLPRYb),U]q}  ~ Y![!!!!!!!G"I"h"j"""C#D#a#c#######,$/$e$x$$$$$$$$$$$% %%%)%*%R%S%o%p%%%%%%%%%%%&&*&+&J&L&Z&[&l&m&&&&&''.'/'C'D'n'o'''((p(r((())))4*=*H*J*R*Z*c*f*u*}*********@+C+L+O+_+e+m+q+t+z+++++,,,,_-a-k-l---#.$.+.-.h.q.t....////&/:/B/S/[/l/t////////S0T00011h1i11111112222223333A4B444444444U5V555555555D6E66666666666660727F7G7I7J7]7^7e7f77788L8_8g8x8888888889999$9%9>9?9H9I9Q9R9k9m99999999:::::;;;;G;I;K;L;;;;;;;;;;;;;;;'<(<*<+<W<X<c<d<<<<<============B>C>O>Q>_>a>c>l>r>w>x>y>>>>>>>??k?l????!@3@7@@@@@@@TAUAZA[AAAjBlBnCoCCCCCDDXDYDjDDDDDDE EEE@EBEkEmEEEEEEEFFFFFFFFFFFF4G5GUGVGGGGGGGGGH%H-H.HIHKHdHfHHHHHHHfIgIKKKKKL)L*L,L.LLLEMNNOROAPIPJPLPNPPP3QSTTT!T,T/TQURUVVVVWWXXzY{YYY/[0[[[[[[[[[\\i\j\\\\\X]Z][]]]]]]]]]]]]]22t.t...*/*/9/9/////111166FFGGIHfHHHKKQ S T T[[\\Z][]]]]]]]]]]]]]22t.t...*/*/9/9/////111166FFGGIHfHHHKKQ S T T[[\\Z]]]]]]]]]]]]9FU,6Af!f\&TXV˶Ndb(!g})^`^J.^`^J.pL^p`L^J.@ ^@ `^J.^`^J.L^`L^J.^`^J.^`^J.PL^P`L^J.^`CJOJQJo(^`CJOJQJo(opp^p`CJOJQJo(@ @ ^@ `CJOJQJo(^`CJOJQJo(^`CJOJQJo(^`CJOJQJo(^`CJOJQJo(PP^P`CJOJQJo(^`^J.^`^J.pL^p`L^J.@ ^@ `^J.^`^J.L^`L^J.^`^J.^`^J.PL^P`L^J.^`^Jo(.^`^J.pL^p`L^J.@ ^@ `^J.^`^J.L^`L^J.^`^J.^`^J.PL^P`L^J. h^h`5\^J.^`^J.pL^p`L^J.@ ^@ `^J.^`^J.L^`L^J.^`^J.^`^J.PL^P`L^J.h ^`hH)h ^`hH.h pL^p`LhH.h @ ^@ `hH.h ^`hH.h L^`LhH.h ^`hH.h ^`hH.h PL^P`LhH.f!XVNd\&9FU!g:k  xh <  d     d %ld3J{yc.q 7env8 p Rm 4" J ? G Qv ?2BYhpn[55HZB-ej1U[ ,sNg&e({EsysTv !#o!%Bz%7& e&& 'H'@M'(5(08(8)E)E+B7+,!-,1-D /k:/K/03R0 1fa1z 3b7@H8`8*9\9;.;D;|D1G%J@GKEQKt8MbcM]N^POjOPRVR\RRCScSgXT6^TY^TwUVVW^ Z^[\E\Wx\t]l^`1`S`!agab1/b<[bcGcUc&d`gOyg_KijNFj*El~}lnfnrnCpMrttat(|tt'uW9uIuNw5}#aJ ~-) Qc{J*}KmKq7;^C41<9`S[JA.o1?'|(&a" _v@~] i;aNkxW.84YP"1P"gAi?2{<EjJN@RTZ@UnknownG* Times New Roman5Symbol3. * Arial7.{ @Calibri5. *aTahoma?= * Courier New;WingdingsA BCambria Math"GG2F lO / lO /an24,],] 2q?^2!xx+Anita Liaka*, Vlatka Rozman, Irma Kalinovino name CHANGE_ME1$      Oh+'0 ( H T ` lx,Anita Lika*, Vlatka Rozman, Irma Kalinovino name Normal.dotm CHANGE_ME13Microsoft Office Word@@G@ @ fL   lO՜.+,0 hp  pfos/,] ,Anita Lika*, Vlatka Rozman, Irma Kalinovi Title  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~Root Entry Fj Data 1TableqOWordDocumentBFSummaryInformation(DocumentSummaryInformation8CompObjy  F'Microsoft Office Word 97-2003 Document MSWordDocWord.Document.89q