Naslov
Mehanizam nastanka fosfaturije u štakora trovanih kadmijem
(Mechanism of phosphaturia in cadmium-intoxicated rats)

Autori
Herak-Kramberger, Carol Mirna

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, doktorska disertacija

Fakultet
Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
14.07

Stranica
100

Mentor
Sabolić, Ivan

Ključne riječi
fosfaturija; transport fosfata; vakuolarna ATPaza; mikrotubuli; endocitoza; kadmij; nefrotoksičnost; bubreg; štakor
(phosphaturia; phosphate transport; vacuolar ATPase; microtubules; endocytosis; cadmium; nephrotoxicity; kidney; rat)

Sažetak
Toksični učinci kadmija na staničnoj razini slabo su poznati. Nefrotoksični učinak kadmija očituje se uglavnom u odsječcima S1 i S2 stanica PK tako što oštećuje reapsorpciju i sekreciju tvari i tekućina u ovom dijelu nefrona. Posljedice dugotrajne izloženosti kadmiju u subkronično i kronično trovanim ljudima i pokusnim životinjama su izražena proteinurija, glukozurija, aminoacidurija, poliurija i fosfaturija. U ovom radu ispitala sam stanične mehanizme koji dovode do poremećaja reapsorpcije Pi u PK i fosfaturije u štakora trovanih kadmijem. Razvila sam eksperimentalni model nefrotoksičnosti u štakora in vivo s poremećajem funkcije PK koji odgovara kliničkoj slici nefropatije uzrokovane dugotrajnoj izloženosti kadmiju u ljudi. Ovakav eksperimentalni model stvorila sam ubrizgavanjem CdCl2 (2 mg Cd/kg dnevno, s.c.) tijekom 14 dana. U VČM izoliranim iz kore bubrega kontrolnih štakora i štakora trovanih kadmijem izmjerila sam o Na+ ovisan prijenos glukoze, Pi i sulfata obilježenih radioizotopima. Primitak glukoze i Pi bio je smanjen u VČM iz štakora obrađenih kadmijem, dok primitak sulfata u istim VČM nije bio promijenjen u poredbi sa kontrolnim VČM. Rabeći poliklonsko protutijelo na prijenosnik Pi tipa II (NaPi-2), imunoblotiranjem i imunohistokemijski sam pokazala da je sadržaj NaPi-2 u četkastoj membrani stanica PK u štakora trovanih kadmijem izrazito smanjen. Nasuprot tomu, sadržaj pora za vodu (AQP 1), u četkastoj membrani nije bio bitno promijenjen uslijed obrade štakora kadmijem. Da bih razjasnila mehanizme djelovanja kadmija u stanici, koji su doveli do smanjenja broja prijenosnika Pi u četkastoj membrani stanica PK, ispitala sam učinak kadmija na endocitozu i aktivnost V-ATPaze in vivo i in vitro. Endocitoza u stanicama PK, koju sam ispitala nakon ubrizgavanja fluorescein-izotiocijanat-dekstrana (FITC-dekstran) i.v. štakorima in vivo, bila je znatno smanjena u štakora obrađenih kadmijem. Aktivnost V-ATPaze (ATPaze osjetljive na bafilomicin), koja je neophodna za zakiseljavanje unutrašnjosti organela endosomsko-lizosomskog odjeljka i time osigurava normalne procese unutarstanične reciklaže membranskih proteina, u VČM iz štakora obrađenih kadmijem, bila je jako smanjena. Pokusi imunoblotiranja i imunohistokemije pokazali su da je sadržaj podjedinica V-ATPaze od 31 kDa i 70 kDa u četkastoj membrani štakora obrađenih kadmijem također drastično smanjen. U in vitro pokusima, aktivnost V-ATPaze osjetljive na bafilomicin u VČM i EV smanjivala se s porastom koncentracije kadmija i s trajanjem izloženosti kadmiju. Na isti je način kadmijem bio inhibiran in vitro proces zakiseljavanja EV. Pored toga, kadmij in vitro povećao je propusnost membrane EV za H+ i tako narušio gradijent koncentracije H+, kojeg stvara V-ATPaza (H+-pumpa). Posljedica ovakvog djelovanja kadmija na aktivnost V-ATPaze može dovesti do oslabljenog zakiseljavanja endosoma, a potom i do poremećene reciklaže prijenosnika četkaste membrane i smanjene reapsorpcije u stanicama PK. Nadalje, imunoblotiranje i imunohistokemijski pokusi sa monoklonskim protutijelom na alfa-tubulin, pokazali su da je kadmij poremetio pravilno ustrojstvo mikrotubula u stanicama PK, i da je sadržaj alfa-tubulina (monomera) bio veći u tkivu bubrega štakora trovanih kadmijem nego u tkivu kontrolnih štakora. Ovi nalazi ukazuju da kadmij uzrokuje depolimerizaciju mikrotubula i/ili sprečava polimerizaciju tubulina. Poremećaj ustrojstva mikrotubula u stanici mogao bi za posljedicu imati ometen proces egzocitoze i stoga smanjen broj molekula NaPi-2 i drugih prijenosnika u četkastoj membrani. Metodom northern blota pokazala sam da je sadržaj specifične mRNA za NaPi-2 u kori bubrega štakora trovanih kadmijem znatno smanjen, dok u sadržaju mRNA za beta-aktin i GAPDH u tkivu kontrolnih štakora i štakora trovanih kadmijem nema bitne razlike. Zaključila sam da je prijenos Pi kroz četkastu membranu stanica PK u štakora dugotrajno izloženim kadmiju, znatno smanjen, i to najvećim dijelom zbog smanjenog broja NaPi-2 u membrani. Uzrok smanjenom broju prijenosnika Pi može biti poremećaj unutarstaničnog kretanja proteina membrane procesima endocitoze i egzocitoze izazvan a) inhibicijom V-ATPaze i zakiseljavanja unutrašnjosti vezikula kadmijem, i b) depolimerizacijom mikrotubula u stanicama PK životinja trovanih kadmijem. Kadmij, također, uzrokuje smanjenje sadržaja specifične mRNA za NaPi-2 u tkivu bubrega, što vjerojatno dovodi do smanjene sinteze NaPi-2.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Temeljne medicinske znanosti

POVEZANOST RADA