Naslov
Utjecaj mutacija metil-transferaze NpmA na vezanje ciljnog adenina i ostvarivanje bakterijske otpornosti na aminoglikozidne antibiotike
(The effect of NpmA methyltransferase mutations on target adenine binding and resistance to aminoglycoside antibiotics)

Autori
Jurić, Ana

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski

Fakultet
Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
29.06

Godina
2011

Stranica
67

Mentor
Maravić Vlahoviček, Gordana

Ključne riječi
Aminoglikozidni antibiotici; otpornost; metil-transferaza NpmA; mutacija
(Aminoglycoside antibiotics; resistance; methyltransferase NpmA; mutation)

Sažetak
Učestalo korištenje aminoglikozidnih antibiotika dovelo je do sve češće pojave otpornosti bakterija na njihovo djelovanje. Jedan od mehanizama otpornosti je metilacija specifičnih baza u 16S rRNA, čime se onemogućava vezanje aminoglikozida, a odvija se putem 16S rRNA metil-transferaza. Poznata su dva mjesta djelovanja takvih enzima: N7 gvanina na položaju 1405 i N1 adenina na položaju 1408. NpmA je prva m1A 16S rRNA metil-transferaza izolirana iz patogenog soja Escherichia coli ARS3 koja metilira adenin na položaju 1408 te pruža otpornost na široki spektar aminoglikozidnih antibiotika. Pretpostavljeno je da bi evolucijski očuvane aminokiseline P106, W107, F177, W197, K199, R200 i R205 mogle sudjelovati u stvaranju veznog mjesta za ciljni adenin i katalitičkom koraku. Cilj rada bio je odrediti kako supstitucija navedenih aminokiselina alaninom utječe na aktivnost metil-transferaze NpmA i otpornost na aminoglikozidne antibiotike. Divlji tip i mutirane varijante gena za metil-transferazu NpmA prethodno su u laboratoriju klonirani u ekspresijski vektor pET-25b(+). Proteini su eksprimirani u soju E. coli BL21(DE3)pLysS uz dodatak IPTG. Pročišćavanjem bakterijskog lizata na koloni Ni-NTA agaroze dobiveni su čisti mutirani proteini za ispitivanje enzimske aktivnosti. Čistoća proteina provjerena je denaturirajućom elektroforezom u poliakrilamidnom gelu. Metilacijskim testom utvrđena je aktivnost mutanata in vitro, dok je u pokusima in vivo ispitana sposobnost ostvarivanja otpornosti u stanicama E. coli, koja je prirodno osjetljiva na kanamicin. Rezultati pokazuju da aminokiseline W107 i W197 imaju važnu ulogu za aktivnost metil-transferaze NpmA jer se njihovom mutacijom značajno smanjuje razina metilacije ribosoma i minimalna inhibitorna koncentracija kanamicina. Mutacijom triptofana na položajima 107 i 197 sprečava se kontakt između ciljnog adenina što je preduvjet za uspješnu katalizu. Aminokiselina F177 vjerojatno ima ulogu u održavanju strukturne stabilnosti enzima. Pojedinačne supstitucije alaninom aminokiselina P106 i F177 ne mogu značajno utjecati na enzimsku aktivnost. Pojedinačna supstitucija aminokiselina K199, K200 i R205 nije pokazala smanjenje aktivnosti u odnosu na divlji tip enzima NpmA. Dobiveni rezultati, kao i poznate strukturne osobine NpmA i srodnih enzima, važni su za prepoznavanje i oblikovanje inhibitora koji bi spriječio bakterijsku otpornost na aminoglikozidne antibiotike.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biologija

POVEZANOST RADA