ࡱ> Y[XG h?bjbjَ Yp ]8888888$\\\\P\hh(kkk$l`B8kkkkkA88hAAAk88\\8888kAA88Lc!\\ HCITOMETRIJSKE ANALIZE SVINJSKIH LIMFOIDNIH I MIJELOIDNIH STANICA IZ PERIFERNE KRVI Svjetlana Terzi1, Lidija `ver2, Zorana Mileti3, Mirko Lojki1, Ivica Valpoti2 1 Hrvatski veterinarski institut, Savska cesta 143, 10000 Zagreb, 2 Veterinarski fakultet Sveu iliata u Zagrebu, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, 3 Klini ka bolnica Dubrava, Aleja izvia a b.b.,10000 Zagreb SA}ETAK Fizi ki i psiholoaki stres mogu poremetiti imunosne funkcije u mlade prasadi iz industrijskog uzgoja. Tako je i u prasadi u dobi od 12 tjedana, prosje ne te~ine 25 kg, iz industrijskog uzgoja utvrena imunodeficijencija na temelju citometrijskih vrijednosti pojedinih subpopulacija limfoidnih stanica (9.7% CD4+, 8.0% CD8+, 36.9% CD5a+, 20.3% CD16+, 6.9% CD21+, 86.3% CD45+, 41.8% CD45RA+, 48.3% CD45RC+ te 6,9% 0-stanica periferne krvi) i mijeloidnih stanica (23.7% CD11b+ i 5.4% SwC3a+). UVOD Primarne imunodeficijencije u prasadi visoko selekcioniranih pasmina uzgajane u mnotvenoj proizvodnji mogu biti na genskoj osnovi ili posljedica poremetnji u embrionalnom razvitku. Sekundarne imunodeficijencije mogu biti uzrokovane paragenetskim initeljima (hranidbeni i ambijentalni uvjeti, zarazne i neoplasti ne bolesti, lijekovi i sl.). Kvalitativno nedostatna hranidba i stres vjerojatno su glavni uzroci oateenja imunosnog sustava prasadi dr~ane u velikim aglomeracijama. Naime, poznata je pojava imunodeficijencije stani nog tipa zbog nedostatka cinka, sastavnog dijela timusnog hormona timulina odgovornog za regulaciju diferencijacije i sazrijevanja T-stanica (NAGLI i HAJSIG, 1993). MATERIJALI I METODE Prasad U pokusu je bilo 15 prasadi kri~anaca iz farmskog uzgoja, u dobi oko 12 tjedana prosje ne tjelesne mase 25 kg. Prasad je odbijena u dobi od oko 25 dana, a nakon odbia hranjena je odgovarajuom krmnom smjesom. Uzorci krvi Venepunkcijom je iz vene jugularis izvaeno po 20 ml krvi uz dodatak 0,2 ml antikoagulansa (Heparin, BELUPO, Koprivnica ). Monoklonska protutijela Monoklonska protutijela za ova istra~ivanja dobivena su od razli itih davatelja (vidi Tablicu 1.) u svrhu testiranja za potrebe 1st Swine CD Workshop-a (Budimpeata, 1992), 2nd Swine CD Workshopa (Davis, CA, SAD, l995) i 3rd Swine CD Workshopa (New Delhi, 1998). Sekundarno protutijelo Kuniji IgG protiv miajeg IgG konjugiran fluorescein-izotiocijanatom (FITC) (Imunoloaki zavod, Zagreb). TABLICA 1. Osobitosti monoklonskih protutijela (mPt) primjenjenih u identifikaciji diferencijacijskih CD antigena subpopulacija svinjskih limfoidnih i mijeloidnih stanica iz periferne krvi metodom jednobojne proto ne citometrije. CD antigenIzotipOznakaPrisutnost na DavateljCD4aIgG2b74-12-4Th stanice, monociti., makrofagiPescovitz, LunneyCD5aIgG2a1H6/8T-limfocitiDominiguezIgG1PG116ADavisIgG1b53b7SaalmllerCD8aIgG2a76-2-11Tc staniceLunneyCD11bIgG12F4monociti, granulociti, makrofagi, NKDominiguezwCD21IgG1BB6-11C9B stanicePescovitzCD45IgG1K252 1E4mijeloidne i limfoidne staniceHaversonCD45RAIgG1MIL13subpopulacije T-limfocita, B-limfocita, makrofagaHaversonCD45RCIgG1MIL5B-limfociti, CD4 limfocitiHaversonnon T non BIgG2aPT 79A0-limfociti (TcR,?)DavisSWC3aIgG2b74-22-15makrofagiPescovitzIgG16F3PescovitzCD16IgG1G7makrofagiKim Izdvajanje limfocita iz periferne krvi Uzorke periferne krvi razrijeene fizioloakom otopinom (1:1) nadslojili smo na Histopaque (SIGMA) u omjeru 2:1 te nakon centrifugiranja izdvojili limfocite, isprali ih dva puta u Mediju 199 (Imunoloaki zavod, Zagreb). Potom smo talogu dodali RPMI 1640 medij (Imunoloaki zavod, Zagreb) obogaen 20%-tnim fetalnim teleim serumom (SIGMA). Vijabilnost limfocita u suspenziji provjerili smo nakon bojenja tripanskim modrilom (SIGMA) brojanjem u hemocitometru (B(rker-T(rkova komorica). Jednobojna proto na citometrija Limfocite (1 x 106 stanica/ml) obilje~ili smo s pomou odabranih mPt protiv svinjskih CD+ stanica, inkubirali ih, isprali i dodali sekundarno protutijelo. Nakon inkubacije i ispranja dodali smo PBS i odredili kvantitativni odnos pojedinih subpopulacija limfocita u proto nom citometru (EPICS, Coulter, Hialeah, SAD). REZULTATI TABLICA 2. Srednje vrijednosti (%) udjela subpopulacija limfoidnih i mijeloidnih stanica iz periferne krvi prasadi u dobi 12 tjedana iz farmskog uzgoja odreen citometrijskom metodom. SubpopulacijaStaniceBroj pretra~enih uzoraka /broj prasadi Srednja vrijednost (%)CD4+Th15/159.7CD5a+T12/1536.9CD8+Tc15/158.0CD21+B12/156.9CD16+limfoidne4/1520.3CD45+limfoidne3/1586.3CD45RA+limfoidne8/1541.8CD45RC+limfoidne8/1548.3nonT nonB+0-stanice12/156.9SwC3a+mijeloidne12/155.4CD11b+mijeloidne4/1523.7 RASPRAVA Fizi ki i psiholoaki stres esti su imbenici koji mogu poremetiti imunosne funkcije u mlade prasadi iz industrijskog uzgoja i izazvati imunodeficijenciju. Na temelju rezultata dobivenih istra~ivanjem subpopulacija limfoidnih i mijeloidnih stanica periferne krvi, mo~e se rei da je sva prasad u naaem pokusu bila imunodeficijentna u usporedbi s podacima iz literature (NAGLI i HAJSIG, 1993; TIZARD, 1996; MARKOWSKA-DANIEL i sur., 1998). Ta pojava mo~e biti posljedica visoke selekcioniranosti i produktivnosti prasadi, ali i proizvodno-tehnoloakih uvjeta na farmi (rano odbie, podno dr~anje na betonskim reaetkama, veliki broj prasadi u odjeljku, hrana i dr.). Tako se pokazalo da je udio CD4+ stanica u perifernoj krvi prasadi u naaem pokusu bio prosje no 9.7%, dakle manji u odnosu na podatke opisane u literaturi, gdje se navode vrijednosti od 23% do 43% za odrasle svinje (TIZARD, 1996). Udio B-limfocita u perifernoj krvi svinje je od 13% do 38% (TIZARD, 1996), a promjene u njihovoj populaciji praene su u naaem pokusu na temelju promjene udjela CD21+ stanica i utvreno je znatno manje (6.9%) CD21+ stanica. Udio CD8+ Tc -stanica bio je takoer ni~i (8.0%) od vrijednosti opisanih u literaturi (17% do 39%) (MARKOWSKA-DANIEL i sur., 1998). Prema rezultatima dobivenim u naaem pokusu vidi se se da je udio djevi anskih i pamteih CD45RA+ i CD45RC+stanica bio ni~i od o ekivanog za ovu dobnu kategoriju svinja. Meutim, udio CD45+ stanica kretao su se u rasponu od 69 do 98.2 % (prosje no 86.3 %) ato je sukladno vrijednostima za mPt K252 1E4 (91%) (HAVERSON i sur., 1994). Sli no je i s 0-stanicama kojih je u promatrane prasadi bilo 6.9% dok se u literaturi navodi oko 5% od ukupnog broja limfocita. Nalaz CD5a+ i CD16+ stanica ne mo~emo usporediti sa vrijednostima za ovu dobnu kategoriju jer ih nismo pronaali u nama dostupnoj literaturi. Podaci za mijeloidne stanice u suglasju su s rezultatima drugih autora. Tako je udio SWC3a+ makrofaga/monocita bio je 5.7% (3% do 18% BLECHA i sur. 1994), dok su CD11b+ stanice bile zastupljene s 23.7 % (18% do 24% prema istim autorima). ZAKLJU AK Na temelju analize dobivenih podataka mo~emo zaklju iti da se u istra~ivane prasadi, s obzirom na pripadnost adultnoj kategoriji svinja, ne radi o nezrelosti imunosnog sustava ve vjerojatno o pojavi imunosupresije. LITERATURA BLECHA, F., T. KIELAN, D.S. McVEY, J.K. LUNNEY, K. WALKER, C.R. STOKES, K. STEVENS, Y.B. KIM, R.M. CHU, T.S. CHEN, M.P. MURTAUGH, C. CHOI, T.W. MOLITOR, K. McCULLOUGH, M.D: PESCOVITZ (1994): Workshop studies on monoclonal antibodies reactive against porcine myeloid cells. Vet. Immunol. Immmunopath. 43, 269-272. HAVERSON, K., M. BAILY, V.R. HIGGINS, P.W. BLAND, C.R. STOKES (1994): Characterization of monoclonal antibodies specific for monocytes, macrophages and granulocytes from porcine peripheral blood and mucosal tissues. J. Immunol. Methods. 170, 233-245. Markowska-Daniel, I., A. Winnicka, W. Klucinski, Z. Pejsak (1997): Flow cytometry analysis of classical swine fever virus infection of piglets. Proceedings of the 4th. International congress of veterinary virology, Edinburgh, Scotland, 24-27 August 1997, 137-140. Markowska-Daniel, I., A. Winnicka, W. Klucinski, Z. Pejsak (1998): Flow cytometry analysis of classical swine fever virus infection. Proceedings of the 15th IPVS Congress, Birmingham, England, 5-9 July 1998., 354. Meyer, D.J., J.W. Harvey (1998): Veterinary laboratory medicine: interpretation and diagnosis. W.B. Saunders Co. Nagli, T., D. Hajsig (1993): Veterinarska imunologija. `kolska knjiga, Zagreb. Tizard, I. R. (1996): Veterinary immunology. 5 th ed. W.B. Saunders Co. PAGE 1 PAGE 2 $&FHJLNhjf h | ~    U V c d i n $ $x|,D/0DE34:\>@LNb d 2"H" jCJ 5B*CJH* 5B*CJ 5B*CJ 5CJH*CJ5CJCJCJH* 5CJH*5CJCJ5CJLJLhh i n o $&4dd$$ 9r $JLhh i n o $&4*,Z,. &/05;Cdvw|(34:?HR\]bgp [*,Z,. &/05;CU$$ir}     $$$dCdvw|U$$ir}     `````$<<$$$TLdV$$i4r}     `````$$V$$i4r}     `````V$$i4r}     `````$$ (34:?HR\]bgp$$U$$ir}     `````8PU$$ir}     `````$$U$$ir}     ````` &8:R^l "$.8>RZ\^pr."0"2"H"J"####:$h$j$t$z$$$$$$$$$$$$$$$$$%%%$%.%8%:%F%Z%d%n%p%%%%%%%%%%%%&&"&$&  _&8:R^lU$$ir}     `````$$ NXV$$i4r}     $$U$$ir}     ````` "$.8>RZpV$$i4r}     $$ Z\^pr."0"2"H"J"####:$h$$d$d$dU$$ir}     H"\"#j$p$r$v$x$$$$$$$$$$$$$$$%% %%8%:%B%D%n%p%|%~%%%%%%%%%"&$&.&0&\&^&h&j&&&&,,..V/X/|/~///2141F1H111 4"40444&5ʾ CJH*mH CJH*mHCJmH5;CJmHB*CJ 5B*CJH* 5B*CJ 5CJH* 5CJH*5CJCJ5CJIh$j$t$z$$$$$$$$$$$$$$$$$%LPLL"$$l4  n ````$d$"$$l4  n %%%$%.%8%:%F%Z%d%n%p%%%%%%%%%%lltt$d$"$$l4  n ````%%%&&"&$&2&H&T&\&atJ$$l4 \n ````$d$J$$l4 \n ```` $&2&H&T&\&^&l&&&&&&&&(5777788888:;<==>0?J?`?b?d?f?h? $\&^&l&&&&&&&&(5ta\ZXXdJ$$l4 \n $d$J$$l4 \n  &5(555v6x6777788;;L<O<<<J=L===>*>>>>?0?2?>?@?B?D?F?J?L?X?Z?\?^?`?f?h?0JmH0J j0JUCJmH5;CJmH ;CJmH;CJCJH*CJ >*CJmH+(5777788888:;<==>0?F?H?J?`?b?d?f?h?h&`#$$' 0&P /R . A!7"7#7$7%. 0 0&P /R . A!7"7#7$7% P [(@(NormalCJmH6@6 Heading 1 $$@&56<@< Heading 2$$dh@&560@0 Heading 3$@&5:@: Heading 4$dh@&5CJ<A@<Default Paragraph Font0O0Style1$ ;CJmH 0O0Style2$ ;CJmH *B@* Body Text$4Q@"4 Body Text 3 $dh."@.Caption xx5, @B,Footer  9r &)@Q& Page Number6P@b6 Body Text 2$CJmH @C@r@Body Text Indent $CJs p)p H"&5h?"06CZh$%%\&(5h?#%&'()*,-./12357$&h?$+4 !!8@0(  B S  ?ST]^egmnsu{|56`abdqt|}UWcino$&*+?@?@klC D * + - . \ ] r s   ! ` a   I J ~  ^`DFQR[]qu{}  HJabegijtuy{ (*>?DF[\acxz;="$=?EGhj|}yz " $ * , - / 9 ; RT34pt{}gimo)+>@FG'(B D ) + 5 6 < = C D R S [ ] a b g h o p       ! & ' + , / 0 T U _ a f g k l t u ~       $ % ? @ H J U V [ \ b c w x }    CFPR  !"IJ`bfgijopsuz{  )*349:=?EFPQVWZ\bcmnrswz $ s t Hrvatski Veterinarski Institu/C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of HVARpo.asdHrvatski Veterinarski Institu/C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of HVARpo.asdHrvatski Veterinarski Institu/C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of HVARpo.asdHrvatski Veterinarski Institu!C:\My Documents\TERZI\HVARpo.docHrvatski Veterinarski Institu!C:\My Documents\TERZI\HVARpo.docHrvatski Veterinarski Institu/C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of HVARpo.asdHrvatski Veterinarski Institu!C:\My Documents\TERZI\HVARpo.docHrvatski Veterinarski Institu/C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of HVARpo.asdHrvatski Veterinarski Institu!C:\My Documents\TERZI\HVARpo.docHrvatski Veterinarski Institu!C:\My Documents\TERZI\HVARpo.doc@# # d# # {---- - - ------$ ``@` ````0@``"`&`,`4`6`t@`>GTimes New Roman5Symbol3& Arial"hTbIF_I&dbIF( 9r0d$!RCITOMETRIJSKE ANALIZE SVINJSKIH LIMFOIDNIH I MIJELOIDNIH STANICA IZ PERIFERNE KRVIHrvatski Veterinarski InstituHrvatski Veterinarski Institu Oh+'0(4D lx    SCITOMETRIJSKE ANALIZE SVINJSKIH LIMFOIDNIH I MIJELOIDNIH STANICA IZ PERIFERNE KRVIITOHrvatski Veterinarski InstituH rvaNormaliHrvatski Veterinarski InstituH 40aMicrosoft Word 8.0k@A@0@c܉@Sc! ՜.+,D՜.+,< hp|   E9 $!  SCITOMETRIJSKE ANALIZE SVINJSKIH LIMFOIDNIH I MIJELOIDNIH STANICA IZ PERIFERNE KRVI Title 6> _PID_GUIDAN{D657074A-7DB4-11D4-8181-A74D3530701F}  !"#$%&'()*+,-./012345678:;<=>?@ABCDEFGIJKLMNOQRSTUVWZRoot Entry Fc!\1Table9WordDocumentYpSummaryInformation(HDocumentSummaryInformation8PCompObjj  FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.89q