Naslov
Matematički model enzimski katalizirane aldolne adicije
(Mathematical model of enzyme catalyzed aldol addition)

Autori
Petranović, Marko

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski

Fakultet
Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije

Mjesto
Zagreb

Datum
19.07

Godina
2011

Stranica
44

Mentor
Findrik Blažević, Zvjezdana

Neposredni voditelj
Sudar, Martina

Ključne riječi
aldolaza ; N-Cbz-3-aminopropanal ; kinetički model ; alkohol dehidrogenaza
(aldolase ; N-Cbz-3-aminopropanal ; kinetic model ; alcohol dehydrogenase)

Sažetak
U ovom je radu proučavana aldolna adicija dihidroksiacetona (DHA) na N-Cbz-3- aminopropanal (aldehid) katalizirana D- fruktoza-6-fosfat aldolazom iz genetski modificirane Escherichia coli (FSA A129S). Radi se o povratnoj reakciji čija je ravnoteža pomaknuta u smjeru nastajanja aldolnog produkta. Obzirom da je aldehid (koji je reaktant u ovoj reakciji) moguće dobiti iz alkohola pomoću alkohol dehidrogenaze (ADH), dio istraživanja je usko povezan s ovim enzimom, obzirom da je zamisao da se aldol može sintetizirati iz alkohola u kaskadnoj reakciji. Aldehid nije topiv u vodi, pa je u svim mjerenjima bilo 10 % etilacetata u sustavu. Ispitana je pH ovisnost aktivnosti aldolaze. Ispitani su različiti puferi, obzirom da se ranije korišteni boratni pufer pokazao neupotrebljiv zbog toga što ADH u njemu nije bila aktivna. Isto se dogodilo i u tris - HCl puferu. Pokazalo se da u pH rasponu od 5, 4 do 9 pufera, aktivnost aldolaze raste, te je maksimalna pri pH 9, 0. pH vrijednosti više od ove nisu bile zanimljive radi stabilnosti reaktanata u reakciji. Osim toga, poznato je da je ADH dobivena iz kvasca stabilna do pH 8, 6. Iznad ove vrijednosti operacijska stabilnost joj znatno pada, iako joj je aktivnost visoka. Stoga su sva daljnja mjerenja provedena u glicin-NaOH puferu pri pH 8, 6. Ispitivana je kinetika reakcije u smjeru nastajanja aldola ispitivanjem utjecaja oba supstrata na početnu brzinu reakcije. Iz navedenih su eksperimentalnih podataka procjenjeni kinetički parametri Vm1, KmDHA, Kmaldehid. Obzirom da se aldehid koje je reaktant u ovoj reakciji može proizvesti iz odgovarajućeg alkohola uz pomoć alkohol dehidrogenaze, dio rada je posvećen ispitivanju djelovanja pojedinih spojeva na aldolazu. Naime, ADH zahtijeva regeneraciju koenzima, te su stoga ispitane sastavnice triju sustava za regeneraciju NAD+: piruvat→ laktat, D - glukono - 1, 5 - lakton→ glukoza, aceton→ izopropanol. Utjecaj svih navedenih spojeva, kao i NAD+ i NADH na početnu brzinu reakcije aldolne adicije je ispitan metodom početnih brzina. Na temelju dobivenih rezultata su procijenjene konstante inhibicije, te je bilo moguće zaključiti koji od navedenih spojeva djeluju kao inhibitori. Ispitan je utjecaj alkohola N-Cbz-3-aminopropanola na početnu brzinu reakcije aldolne adicije. Aldolna adicija DHA na N-Cbz-3-aminopropanal je provedena u kotlastom reaktoru, te je dobivena 80 %-tna konverzija supstrata. Oba su supstrata bila u ekvimolarnom odnosu na početku reakcije. Proveden je i ponovljivi šaržni eksperiment kako bi se vidjela operacijska stabilnost aldolaze. Supstrati u ekvimolarnom odnosu su tri puta dodavani te je na kraju postignuta koncentracija aldola od oko 80 mM. Pokazalo se da u vremenu reakcije od 150 minuta nije došlo do pada aktivnosti aldolaze. U drugom ponovljivom šaržnom eksperimentu, koji je proveden kod više početne koncentracije supstrata, došlo je do taloženja aldola što pokazuje njegovu ograničenu topljivost u vodenom mediju.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biotehnologija

POVEZANOST RADA