Naslov
Uzimanje kliničkog materijala i metode virološke dijagnostike
(Clinical specimens and diagnostic methods in virology)

Autori
Mlinarić-Galinović, Gordana

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Poglavlja u knjigama, pregledni

Knjiga
Praktikum iz osnova medicinske mikrobiologije i parasitologije

Urednik/ci
Kalenić, Smilja ; Mlinarić-Galinović, Gordana

Izdavač
Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Grad
Zagreb

Godina
1997

Raspon stranica
101-105

ISBN
99533-6255-13-8

Ključne riječi
klinički materijal, direktna virološka dijagnostika
(clinical specimens, direct viral diagnosis)

Sažetak
Da bi bila učinkovita virološka dijagnostika mora biti točna i brza, a sam postupak dijagnostike odvija se u tri faze: uzimanje kliničkog materijala, virološka obrada istog te pravilna interpretacija nalaza pretrage. Kako istu kliničku sliku bolesti mogu uzrokovati različiti virusi, potrebno je uzročnika bolesti dokazati bilo izravnim ( dokaz virusa ili virusnog antigena) ili neizravnim ( dokaz specifičnih-virusnih protutijela) virološkim metodama. 1. Uzimanje kliničkog materijala. Uzorak za pretragu uzima se iz tkiva, organa ili tjlesnih tekućina čovjeka. Klinički materijal za izravnu dijagnostiku je uzorak uzet s mjesta gdje se virus u tijelu umnaža ili izlučuje, dočim je za neizravnu dijagnostiku to uzorak krvi ili cerebrospinalnog likvora. Uzorci se uzimaju u sterilne posudice i po mogućnosti pod sterilnim uvjetima. a) izravna virološka dijagnostika: - uzorak stolice: uzima se 3-4 grama (uzorak veličine lješnjaka) stolice u platičnu posudicu s šličicom na čepu, - uzorak urina: uzima se 10-20 ml srednjeg mlaza urina u staklenu ili plastičnu posudicu, - uzorak cerebrospinalnog likvora: strilnom punkcijom uzima se 3-5 ml likvora u epruvetu, - uzorak nazofaringealnog sekreta: pomoću aspiratora uzima se 1-3 ml sekreta u mukozni ekstraktor. - brisevi kože i sluznica ( npr. oka, usne šupljine, vanjskog uha, ždrijela, rektuma, uretre, genitalne sluznice): mjesto se obriše drvenim štapićem omotanim vatom i uroni u epruvetu s transportnim medijem, - rijetko se uzima uzorak krvi ( ako se dokazuje virus ili antigen u stanicama krvi, mora se uzorku dodati antikoagulans ), bioptičkog materijala, salive, kornealni otisak itd. Odmah po uzimanju materijal se pohranjuje na 4oC i obrađuje unutar 24 sata. b) neizravna virološka dijagnostika: - uzorak krvi: uzima se 5 ml venske krvi, odstoji na sobnoj temperaturi da se stvori ugrušak, a potom se odvoji serum za testiranje. Uzorke krvi i likvora često uzimamo u dva navrata u razmaku od dva ili više tjedana kako bi mogli dokazati dinamiku specifičnih protutijela . Prije obrade ovi uzorci mogu biti pohranjeni na +4oC nekoliko tjedana ili na - 20oC nekoliko mjeseci. 2. Dijagnostičke metode Tablica 1. Dijagnostika virusnih infekcija Direktna dijagnostika Indirektna dijagnostika IZOLACIJA virusa TIPIZACIJA izoliranog virusa DETEKCIJA virusa DETEKCIJA specifičnih protutijela Kultura stanica (CPE, HAD, DFA i IFA)NT, DFA i IFA, IHADEM, IEM, PCR, CCIEP, DFA i IFA, EIA, Lateks aglutinacija i dr.grupno specifični test: RVK, tipnospecifični testovi: NT, IH, IFA, EIA, RIA,IB i dr. Pileći embrio ( HA)IH Pokusna životinja (znaci bolesti)NT CPE -citopatični efekt, HAD -hemadsorpcija, NT-test neutralizacije, DFA -direktni test fluorescentnih protutijela - izravna imunofluorescencija, IFA -indirektni test fluorescentnih protutijela - neizravna imunofluorescencija, IHAD -inhibicija hemadsorpcije, EM -elektronska mikroskopija, IEM -imunoelektronska mikroskopija, PCR ( polymeraza chain reaction) -polimeraza lančana rekacija, CCIEP ( Counter current immunoelectrophoresis) -protusmjerna imunoelektroforeza, RIA (radioimmuno assay)-radioimuno test, EIA (enzyme immuno assay)-imunoenzimni test, RVK -reakcija vezanja komplementa, IH -inhibicija hemaglutinacije, IB -imunoblot testovi. Za tipizaciju izoliranog virusa i/ili detekciju virusa direktno iz kliničkog materijala danas se umjesto hiperimunih životinjskih seruma rabe monoklonska protutijela. O izolaciji virusa i njihovoj tipizaciji vidi u 2, 3 i 4.vježbi iz virologije. O indirektnoj dijagnostici virusnih infekcija vidi u 4, 5 i 6. vježbi iz virologije i u Dodatku vježbama iz virologije. Detekcija virusa Elektronska mikroskopija ( EM ) i Imunoelektronska mikroskopija ( IEM ) - viruse koji su teško kultivabilni ( npr. hepatitis A virus ili adenoviruse koji uzrokuju gastroenteritis) možemo dokazati direktno iz kliničkog materijala (npr. iz stolice bolesnika) postupkom EM ili uz pomoć specifičnih protutijela u IEM. IEM je 30-tak puta osjetljivija od EM. Uzorak se prvo pročisti centrifugiranjem, a zatim se pomješa sa specifičnim protutijelima i inkubira 1 sat na 370C. Nastale komplekse antigen - protutijelo se sedimentira centrifugiranjem i potom resuspendira u destiliranoj vodi. Dobivena se suspenzija pomiješa s 3% fosfovolframovom kiselinom i podesi pH na 6.0. Mješavina se nanese na bakrenu mrežicu te promatra u elektronskom mikroskopu. O polimeraza lančanoj reakciji ( PCR ) vidi u Dodatku vježbama iz virologije. Protusmjerna imunoelektroforeza ( CCIEP) - ovim testom otkriva se virusni antigen ( npr. HBsAg, dokaz rota virusa iz stolice bolesnika ). Agaroza, otopljena u puferu ( alkalni pH ), prelije se preko staklene ploče i ostavi da se skrutne. U dobivenom gelu usjeku se zdenci. Poznati referentni antigen, ili uzorak koji se ispituje, ukapaju se u zdence uz katodu, a protutijelo se ukapa u zdence uz anodu. Ploča se priključi na komoru za elektroforezu, te se propusti istosmjerna struja. U alkalnoj sredini antigen, koji je negativnog naboja, putuje prema anodi, a protutijelo, zahvaljujući endosmotskim silama, prema katodi. Rezultat takvog putovanja u suprotnom smjeru je precipitacijska linija koja nastaje za 1 do 2 sata tj. kad dođu u kontakt ekvivalentne koncentracije antigena i specifičnog protutijela. Izravna imunofluorescencija (DFA): dokaz respiratornog sincicijskog virusa (RSV) u stanicama iz nazofaringealnog sekreta bolesnika / antigen: RSV u epitelnim stanicama, protutijela: monoklonska protutijela na koja je vezana fluorokromna boja.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Kliničke medicinske znanosti

POVEZANOST RADA