Naslov
Ekspresija i pročišćavanje rekombinantnog humanog galektina-3
(Expression and purification of recombinant human galectin-3)

Autori
Dugonjić, Ana

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski

Fakultet
Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
17.07

Godina
2009

Stranica
57

Mentor
Dumić, Jerka

Ključne riječi
galektin-3; ekspresija; pročišćavanje
(galectin-3; expression; purification)

Sažetak
Galektini su proteini iz skupine lektina koji putem specifičnih interakcija sa β-galaktozidnim strukturama glikokonjugata sudjeluju u tumačenju bioloških informacija pohranjenih u glikokonjugatima. Galektin-3, lektin 29-32 kDa, specifično prepoznaje -galaktozidne strukture glikoproteina, a njegova točna fiziološka uloga, kao ni mehanizam regulacije, do danas nisu u potpunosti razjašnjeni. Smješten je u stanici, na staničnoj površini i u izvanstaničnom matriksu te je uključen regulaciju brojnih bioloških procesa kao što su adhezija stanica za izvanstanični matriks, rast i diferencijacija stanica, stanični ciklus i signaliziranje te apoptoza. Također, čimbenik je koji utječe na regulaciju razvoja, imunih reakcija, razvoj i rast tumora te metastaziranje. Cilj ovog rada bio je postaviti postupak za što učinkovitiju proizvodnju rekombinantnog humanog galektina-3 (rh-gal-3). U tu je svrhu korišten ekpresijski sustav E. coli BL21(DE3)Star/pET-3cLGAL. Uzgojena je bakterijska kultura koja je dodatkom induktora kontrolirano eksprimirala rh-gal-3 koji je iz bakterija oslobođen soniciranjem taloga tih stanica. Galektin-3 je iz staničnog homogenata, pročišćenog centrifugiranjem i filtriranjem, odijeljen automatiziranom afinitetnom tekućinskom kromatografijom nakon što se selektivno vezao na kolonu laktozil – Sepharose s koje je eluiran otopinom visoke koncentracije laktoze. Svi ostali proteini staničnog homogenata u koloni su se zadržali kraće, zato što se nisu vezali za laktozu na koloni, te su eluirani prije galektina-3 puferom. Dijalizom prema vodi laktoza je uklonjena iz otopine uzorka koja je tada u svrhu potvrde identiteta i provjere čistoće rh-gal-3 analizirana denaturirajućom SDS - poliakrilamidnom elektroforezom i Western blotom. Nakon razdvajanja na gelu, u svrhu potvrde identiteta, uspoređivane su vrpce odijeljenih proteina uzorka s pozitivnom kontrolom - čistim rh-gal-3. U Western blot metodi membrana s proteinima uzorka inkubirana je s primarnim protutijelom na galektin-3 i nakon toga sa sekundarnim protutijelom (obilježenim enzimom), koje se vezalo na primarno te je galektin-3 vizualiziran kolorimetrijskom metodom nakon dodatka supstrata za enzim sekundarnog protutijela. Koncentracija rh-gal-3, u dijalizom pročišćenoj otopini, određena UV/VIS spektrofotometrijom pomoću specifične apsorbancije čistog rh-gal-3. Nakon liofilizacije otopine uzorka izolirani rh-gal-3 je pohranjen na niskoj temperaturi. Ovaj rad pridonio je razvoju preparativne metode kojom je proizveden rekombinantni rh-gal-3 koji će se koristiti u ispitivanjima njegovih izvanstaničnih bioloških učinaka.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biologija

POVEZANOST RADA