1¾«F0r{{€€NORMAL.STYEPLX800@bŠŁz|{~µ  RH: SHORT COMMUNICATIONS SEROLOGIC SURVEY FOR LEPTOSPIRAE IN EUROPEAN BROWN BEARS (URSUS ARCTOS) IN CROATIA Zvonko Modri}1 and Djuro Huber2, 1 Department of Microbiology and Infectious Diseases, Veterinary Faculty of the University of Zagreb, Heinzelova 55, 41000 Zagreb, Republic of Croatia, 2 Department of Biology, Veterinary Faculty of the University of Zagreb, Heinzelova 55, 41000 Zagreb, Republic of Croatia Corresponding author: Djuro Huber Biology Department Veterinary Faculty Heinzelova 55 41000 Zagreb Republic of Croatia Phone: 38-41-290-111 Fax: 38-41-214-697 ABSTRACT: From 1981 to 1991, sera of 42 European brown bears (Ursus arctos) from three areas in Croatia were tested for antibodies against 12 Leptospira interrogans serovars: grippotyphosa, sejroe, australis, pomona, canicola, icterohaemorrhagiae, tarassovi, saxkoebing, ballum, bataviae, poi and hardjo. Diagnostic levels of antibody were found in 17 of 42 (40%) sera. Evidence of exposure to at least one of the serovars was found in: (1) seven of 14 (50%) free-ranging bears from the Lika region, (2) four of 12 (33%) free-ranging bears from the Gorski kotar region, (3) zero of six (0%) orphaned cubs from the Gorski kotar region, and (4) six of 10 (60%) captive bears from the Zagreb Zoo. Evaluation of the magnitude of antibody titers implicated the following serovars: (1) australis in five bears, (2) sejroe in two bears, (3) canicola in one bear, and (4) icterohemorrhagiae in one bear. There was a strong correlation between serovars implicated by this survey and serovars previously isolated from small mammals in Croatia. Key words: European brown bear, Ursus arctos, leptospirosis, Leptospira interrogans, serovars, serology, survey, Croatia. There are few reports of antibodies against leptospirae in bears. Isolation of leptospirae or the evidence of disease in bears have not been reported. Kleinschmidt (cited in Kathe and Mochmann, 1967) found antibodies against Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae in a captive circus bear in Germany. Antibodies against serovar pomona (1:400) and serovar autumnalis (1:200) were found in a 2-yr-old female American black bear (Ursus americanus) and against serovar pomona (1:1,600) and serovar icterohaemorrhagiae (1:400) in a female cub from Pennsylvania (Matula et al., 1980). Two of 196 American black bears from Idaho had low antibody titers to serovar grippotyphosa (Binninger et al., 1980). In Gorski kotar in Croatia, Karlovi} et al. (1985) found antibodies in three of ten European brown bears (U. arctos). One each was positive to serovar grippotyphosa, saxkoebing or sejroe. Karlovi} et al. (1990) reported on 73 brown bear sera from Croatia; nine of 44 from Gorski kotar, two of eight from Lika, and one of seven from Hrvatsko primorje were positive. Approximately 400 brown bears are believed to inhabit Croatia (Huber and Mori}, 1989). They are part of the Dinara mountains population which is the largest in south-western Europe and is the source for reintroductions to other countries. Thus the knowledge about the health status of Croatian bears is an important management factor. Our objectives were to determine (1) the prevalence of antibodies against leptospirae in bears in Croatia, (2) the serovars with which do the bears get in touch, (3) the possible sources of infection for bears, and (4) to find eventual evidence of disease in bears. Blood samples were taken from 22 male and 20 female European brown bears. Twenty-six (18 males and eight females) were sampled during capture for radio-tagging in Croatia. Fourteen were captured in Lika (44o55'N, 15o39'E) and 12 in Gorski kotar (45o27'N, 14o38'E). Age was estimated by counting cementum layers around the root of the extracted rudimentary first premolar tooth (Stonenberg and Jonkel, 1966). The mean age of the free-living bears was 5.0 years (SD=2.9, range 1-12 years). An additional six bears (one male and five females) were 1 to 3-mo-old orphaned cubs, originating from Gorski kotar. The remaining seven bears (three males and four females) were from the Zagreb Zoo, with mean age of 7.2 years (SD=4.3, range 0.4-14 years). Blood samples were taken from the femoral vein or artery during chemical immobilization with ketamine hydrochloride (11 mg/kg, Ketalar, Parke-Davis, Berlin, Germany) and xylazine hydrochloride (6 mg/kg, Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany). After separation, serum was stored at -18 C. The microscopic agglutination test (Gochenour et al., 1958) was performed for 12 L. interrogans serovars: grippotyphosa, sejroe, australis, pomona, canicola, icterohaemorrhagiae, tarassovi, saxkoebing, ballum, bataviae, poi and hardjo. The initial serum dilution was 1:100; positive sera were further diluted to the end-point of 50% agglutination. Microagglutination titers of =1:100 were considered as indicative of previous exposure. If sera were positive to two or more leptospirae serovars, the serovar with the highest antibody titer was concluded the serovar that caused infection. However, occasionally cross-reactivity among serovars may result in a titer that may be the same or even higher (Modri} et al., 1985). For eight sera that had the same titers to more than one serovar, we didn't attribute the source of infection. Chi-squared test (Burington and May, 1958) was used for statistical comparisons of results; P < 0.05 was considered as statistically significant difference. We found antibodies against leptospirae in 17 of 42 (40%) European brown bear sera in titers from 100 - 2,000 (Table 1). Antibodies against leptospirae were found in seven of 14 samples from Lika, in four of 12 from Gorski kotar, and in six of 10 from the Zagreb Zoo. All six bear cubs, found in Gorski kotar, were negative. Highest antibody titers were to serovar australis in five, sejroe in two, and canicola and icterohaemorrhagiae each in one serum. In eight sera we found the same antibody titer for two to five serovars (Table 1). None bears showed evidence of disease at the time of sampling. The 40% antibody prevalence to leptospirae we found in Croatia is the highest published for bears. Earlier Karlovi} et al. (1985; 1990) reported 15 of 83 (18%) bears positive. Their significantly lower percentage (Chi2 = 6.22, P<0.02, Chi-squared test) might be explained by the use of the paper strips with dried blood which is a less sensitive method. Comparison of our results with the earlier studies (Karlovi} et al., 1985; 1990) is also limited because their method didn't permit ranking the frequency of titers. The prevalence of antibodies in captive bears (six positive of 10, 60%) was higher than in free-living and free-born animals (11 positive of 32, 34%), but the difference was not statistically significant (Chi2 = 1.1, P<0.3, Chi-squared test). There were no significant differences in antibody prevalence between the bears from Lika and Gorski kotar, or between ages and sexes (Chi-squared tests). Antibody titers against serovar australis were highest in five bears (Table 1). In Croatia, serovar australis is a cause of leptospirosis in humans (Zaharija, 1955) and has been isolated from the kidney of clinically healthy cat (Modri}, 1978). Bor~i} et al. (1982) isolated serovar australis from four species of small mammals (Apodemus agrarius, A. sylvaticus, A. flavicollis and Clethrionomys glareolus) in Croatia. Four other leptospirae serovars (grippotyphosa, pomona, sejroe, and bataviae) also were isolated from 15 small mammal species. These data indicate that small mammals are potential sources of infection with serovar australis for other animals, including European brown bears. Antibodies against serovar sejroe were highest in two bear sera. The results of Bor~i} et al. (1982) also indicate the possibility of infection of bears from small mammals. Antibodies against serovar icterohaemorrhagiae in the Zagreb Zoo bear may be due to infection from rats (Rattus norvegicus) which is the main reservoir of this leptospirae serovar in Croatia (Zaharija and Peri}, 1969). Antibodies against serovar canicola indicate the possibility of contact with dogs which is the only documented reservoir of serovar canicola in Croatia (Zaharija, 1954). Free-living rats and mice, and stray dogs are practically the only mammals which can get in contact with the bears in cages in the Zagreb Zoo. Bears are opportunistic feeders that forage on and below ground. Mammalian protein comprise only a small proportion of the European brown bear's diet (<1% diet volume and 4% frequency of occurrence in scats), but the share of small mammals in protein is 75% (Cicnjak et al., 1986). We speculate that the leptospirae infections in bears depend on distribution of this agent among small mammals. The high prevalence of antibodies against leptospirae in bears in Croatia indicate the circulation of certain leptospirae serovars in their population. The absence of clinical cases in our sample doesn't exclude the possibility of subclinical or past infections. We thank the officials of the Plitvice Lakes and Risnjak National Parks, and of the Zagreb Zoo for giving us an opportunity to take the brown bear blood samples. Field work was in part sponsored by the National Geographic Society. Draft of the manuscript was improved by revision of Dr. Elizabeth Williams. LITERATURE CITED BINNINGER, C. E., J. J. BEECHAM, L. A. THOMAS, AND L. D. WINWARD. 1980. A serological survey for selected infectious diseases of black bears in Idaho. Journal of Wildlife Diseases 16: 423-430. BOR^I], B., H. KOVA^I], Z. [EBEK, B. ALERAJ, AND N. TVRTKOVI]. 1982. Small terrestrial mammals as reservoirs of leptospires in the Sava valley (Croatia). Folia Parasitologica 29: 177-182. BURINGTON, R. S., AND D. C. MAY. 1958. Handbook of probability and statistics with tables. Handbook Publishers, INC., Sandusky, Ohio, p. 175. CICNJAK, L., D. HUBER, H. U. ROTH, R. L. RUFF, AND Z. VINOVR[KI. 1987. Food habits of brown bears in Plitvice Lakes National Park, Yugoslavia. International Conference on Bear Research and Management 7: 221-226. GOCHENOUR, W. S., C. A GLEISER, AND N. K. WARD. 1958. Laboratory diagnosis of leptospirosis. Annals of the New York Academy of Sciences 70: 421-426. HUBER, D., AND S. MORI]. 1989. [tete od mrkih medvjeda u Jugoslaviji. In Zbornik radova 3. simpozijuma "Savremeni pravci uzgoja divlja~i", S. Valentin~i~ (ed.). Savez veterinara i veterinarskih tehni~ara Jugoslavije, Ljubljana, Slovenija, pp. 197-202. KARLOVI], M., H. KOVA^I], AND A. FRKOVI]. 1990. Prou~avanje prisutnosti protutijela leptospira u krvi medvjeda (Ursus arctos L.). Veterinarska stanica 21: 331-334. ______, ______, ______, AND M. LACKOVI]. 1985. Prisutnost protutijela leptospira u krvi medvjeda s podru~ja Gorskog Kotara. Veterinarski arhiv 55: 255-258. KATHE, J., AND H. MOCHMANN. 1967. Leptospiren und Leptospirosen. Teil II. VEB Gustav-Fischer Verlag, Jena, Germany, p. 668. MATULA, G. J., J. S. LINDZEY, AND H. ROTHENBACHER. 1980. Sex, age, and seasonal differences in the blood profile of black bears captured in northeastern Pennsylvania. International Conference on Bear Research and Management 4: 49-56. MODRI], Z. 1978. Prirodna i eksperimentalna leptospiroza u ma~ke. Veterinarski arhiv 48: 147-156. ______, M. HERCEG, @. @UPAN^I], S. BAMBIR, V. HAHN, AND P. RAMADAN 1985. Leptospiroza pasa u Zagrebu i okolici uzrokovana serolo{kim tipom icterohaemorrhagiae. Veterinarski arhiv 55: 93-102. STONENBERG, R. P., AND C. J. JONKEL. 1966. Age determination of black bears by cementum layers. The Journal of Wildlife Management 30: 411-414. ZAHARIJA, I. 1954. Sojevi L. canicola izolirani iz pasa u Zagrebu (Hrvatska). Veterinarski arhiv 24: 13-14. ______ 1955. Leptospira australis A (Veseli}i), izolirana u Hrvatskoj. Vojnosanitetski pregled 12: 535-536. ______, AND M. PERI]. 1969. Istra`ivanje leptospiroze u `ivotinja u Hrvatskoj. - VII [takor (E. norvegicus) kao klicono{a u gradovima Zadru, [ibeniku, Splitu, Karlovcu, Sisku i Vara`dinu. Veterinarski arhiv 39: 71-73. Recived for publication 19 November 1992. ÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜ܀©yµ’’¶t’’o’’#j9’’FgG`W]XVZ’’ÜÜÜÜÜÜÜÜ  @ Z[tń’’ómk’’phq’’wc»’’Å^Ę’’ŃYÜ’’éTė’’  ėńvó’’üqž’’l’’g’’#b%’’.]0’’:X<’’<BvD’’LqN’’QlV’’\g9’’BbV’’\]o’’wX’’Ÿv:’’=q>’’Cl[’’`ga’’gbx’’‚]ƒ’’ŽX›’’›„v¦’’±qŗ’’Ķl ’’ g) ’’3 bq ’’v ]w ’’ X— ’’—  v“ ’’Ē qW ’’d lé ’’ź gģ ’’ņ b ’’# ]% ’’/ X3 ’’3 9 v’’o#’’$hD’’EaM’’NZ¦’’§U©’’“P3      “æ’’ĢvĪ’’ŌqÖ’’ßlį’’ēgé’’ńbó’’]’’X’’v’’%q'’’/l1’’4g9’’?bó’’ō]¤’’­X­·’’½vŹ’’Ņq×’’źll’’mev’’w`m’’nYv’’wT  wM’’Vv‘’’šqH’’Qlv’’~g’’‡b‰’’Š]Œ’’–X–˜’’™v›’’¦q«’’øl¹’’Āgń’’žb’’]’’X’’v¦’’Æq’’l±’’Äg’’’ b ’’ ]Œ ’’” X” õ ’’ż v)’’L)tN)o*m›-’’®-h{.’’|.c~.’’†.^Ū.’’å.Yå.ę.’’ļ.v˜/’’š/q›/’’„/l0’’!0g"0’’%0b&0’’10]20’’40X4050’’=0v>0’’B0qF0’’„/l0’’!0g"0’’%0b&0’’10]20’’40X€øiŗ\ŌOÖBŲB&0’’ <ą <ą <ą= šŲŚnÜn n1n3’’5’’7’’9’’ą=  <ą9mno’’q’’s’’u’’w’’y’’’’’’’ <ą ’ ’’µ’’Ź’’Ś’’é’’’’’yy+y << +8n¶nø’’ī aJaSa5a‘aØDąØDš ØDą ØDą <ą <ą‘›n+nän”n«!n?$nu%nw%’’y%’’ ØDą ØDąØDąØDšØDšą <ą y%‹%x%mO&` '`›'`p(`)`*`ØDšØDšØDąØDąØDąØDąØDąØDą <Š0żą <Š0ż<*Ø*nE+nĀ+n­,n-nŠ-na.nĪ.n;/nØDąØDąØDąØDą <Š0żą ;/0n0’’0’’E0’’F0’’G0’’ØDą <Š0żąŅŽCƒ.’’„D62T"‹ŽCÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜ ¬Õź<B+!Œ&é+Ę/ ™éyiŲD ÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜĘ/8ÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜĘ/€=Ē/’’’’’’ÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜ)8;MZdltSurvey for leptospiraeModri} & Huberdhbear. leptospiraeJWD revision4 (2Beth)05/04/9311/09/91Ę/ÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜÜ