Naslov
Funkcionalna karakterizacija homologa atipičnih seril-tRNA-sintetaza
(Functional characterization of atypical seryl-tRNA synthetase homologues)

Autori
Šubašić, Deni

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
10.07

Godina
2009

Stranica
60+XIV

Mentor
Weygand-Đurašević, Ivana

Neposredni voditelj
Močibob, Marko

Ključne riječi
seril-tRNA-sintetaza ; homolozi ; N-terminalna domena ; proteinske fuzije ; reakcija aminoacilacije ; nekovalentni kompleksi
(seryl-tRNA synthetase ; homologues ; N-terminal domain ; fusion proteins ; aminoacylation assay ; noncovalent complex)

Sažetak
Seril-tRNA-sintetaze (SerRS) su esencijalni enzimi koji kataliziraju esterifikaciju pripadnih tRNA serinom u svim organizmima, što je nužno za sintezu proteina na ribosomima. U nekim bakterijskim vrstama, neobični homolozi SerRS metanogenog tipa koegzistiraju sa standardnom SerRS bakterijskog tipa. Njihova funkcija je trenutno nepoznata. Preliminarna istraživanja su pokazala da homolozi SerRS metanogenog tipa iz alfa-proteobakterija Agrobacterium tumefaciensa (At) i Bradyrhizobium japonicuma (Bj1 i Bj2) aktiviraju određene aminokiseline s promijenjenom specifičnošću, iako se one ne prenose na pripadnu tRNA. Ti proteini mogu predstavljati atipične aminoacil-tRNA-sintetaze kojima nedostaje vezna domena za tRNA pružena in trans. S ciljem provjere te hipoteze, dizajnirane su proteinske fuzije između svakog homologa SerRS iz Methanosarcina barkeri: At, Bj1 i Bj2 te njene N-terminalne domene zadužene za vezanje tRNA. Genske fuzije su konstruirane uz pomoć preklapajućeg (eng. overlap) PCR-a te klonirane u Escherichiji coli. Zahvaljujući njihovom dizajnu s His6-privjeskom na N-terminalnim domenama, proteini su pročišćeni u jednom koraku uz pomoć afinitetne kromatografije na Ni-NTA agarozi. Ukupna tRNA potrebna za aminoacilacijsku reakciju izolirana je iz A. tumefaciensa i B. japonicuma. Nakon toga je uslijedilo ispitivanje aminoacilacijske aktivnosti proteinskih fuzija. Dodatno je ispitano i nastajanje nekovalentnih kompleksa proteinskih fuzija i tRNA uz pomoć retardacijske gel- elektroforeze. Proteinske fuzije su pokazale adenilacijsku, no ne i aminoacilacijsku aktivnost. N-terminalna domena je bila funkcionalna i ostvarivala je nespecifične komplekse s tRNA. Unatoč tome, izostao je prijenos aktiviranih aminokiselina na pripadne tRNA. Zahvaljujući tome je zaključeno da su homolozi divergirali u funkciji i da aktiviraju aminokiseline za neki drugi metabolički proces nevezan uz biosintezu proteina.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Kemija, Biologija

POVEZANOST RADA