Naslov
Ciljana mutageneza gena otcC bakterije Streptomyces rimnosus R6 : novi način dobivanja derivata oksitetraciklina
(Targeted mutagenesis of the otcC gene in Streptomyces rimosus R6 : novel way of making derivatives of oxytetracycline)

Autori
Perić, Nataša

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, doktorska disertacija

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
10.11

Godina
1999

Stranica
154

Mentor
Hranueli, Daslav

Ključne riječi
gen otcC; (novi) poliketidi; rekombinacija; mutanti otcC; mjesno-specifična mutageneza; oksitetraciklin; Streptomyces rimosus
(otcC gene; (novel) polyketides; recombination; otcC mutants; site-specific mutagenesis; oxytetracycline; Streptomyces rimosus)

Sažetak
Poliketidi su obitelj strukturno složenih prirodnih spojeva od kojih su neki aktivne supstancije mnogih važnih lijekova. Njihova vrijednost potakla je brojna istraživanja na polju razvoja uputa za inženjering sintetaza poliketida (PKS) u stvaranju novih poliketida. Nedavna istraživanja pružila su uvide u enzimsku specifičnost biosinteznih puteva poliketida i pokazala da se genetičkom manipulacijom različitih PKS mogu sintetizirati “neprirodni” prirodni poliketidni spojevi. Rezultati prikazani u ovom radu značajni su za to područje biotehnologije. Ciljanom mutagenezom gena otcC željelo se načiniti derivate OTC-a u soju Streptomyces rimosus R6, proizvođaču oksitetraciklina (OTC). Pretpostavlja se da gen otcC kodira C-6 hidroksilazu, koja sudjeluje u kasnim stupnjevima biosinteze OTC-a i koja pokazuje veliku sličnost s nekoliko hidroksilaza flavinskog tipa. Kako bi se napravila konstrukcija željenih mutacija tog gena, razvijen je sustav za njegovo prekidanje i zamjenu. Pozitivni probirni biljeg (gen za otpornost prema gentamicinu, gen gmr) uveden je dvostrukim prekriženjem u gen otcC na kromosomu soja R6, pomoću nestabilnog plazmida. Metodologija prekidanja gena otcC predstavlja jedinstven primjer brojnih i različitih pokušaja izolacije stabilnih otc mutanata proučavanih do danas. Rekombinantni soj otcC sintetizira tri nova triciklička spoja koja imaju 17 i 16 C-atoma, umjesto 19 poput OTC-a. Pojava ovakvih spojeva ilustrira vrlo veliki stupanj aberantne aktivnosti “minimalnog” PKS-a u rekombinantu otcC, što upućuje da u biosintezi poliketida u vrsti S. rimosus sudjeluje multienzimski kompleks sastavljen ne samo od enzima koji oblikuju poliketidni lanac (min PKS), već i od enzima koji sudjeluju u kasnijim reakcijama modifikacije. Uzajamno djelovanje proteina unutar takvog kompleksa može utjecati na prirodu sintetiziranih spojeva. Na temelju struktura novih spojeva može se zaključiti sljedeće: a) posljedica prekidanja gena otcC vrlo je vjerojatno polarni učinak na ekspresiju gena otcZ, koji se prepisuje na istoj policistronskoj mRNA, pa stoga pretpostavljamo da taj gen sudjeluje u C-4 N-metilaciji ; b) dva spoja koje sintetizira mutant otcC na jednom kraju poliketidnog lanca imaju amino-skupinu, što podupire hipotezu o malonamidu kao početnoj jedinici OTC-a. Navodna aktivna mjesta hidroksilaze, smještena u blizini N-terminalne regije proteina OtcC u području visoko konzerviranog mjesta vezivanja flavinskog nukleotida, izmijenjena su mjesno-specifičnom mutagenezom in vitro bez mijenjanja okvira čitanja. Biljeg gmr je u rekombinantu otcC zamijenjen željenim mutantnim alelom tijekom drugog događaja integrativne rekombinacije. Gubitak ovog probirnog biljega i podrobna analiza DNA dokazali su da je prekinuti gen zamijenjen mutiranim genom na kromosomu. Dobiveni metaboliti će se kemijski analizirati kako bi se utvrdila konačna funkcija gena otcC. Provjerit će se i korisna biološka svojstva tih metabolita.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Prehrambena tehnologija

POVEZANOST RADA