Naslov
Genetička i biokemijska analiza mutanata kvaščeve seril-tRNA-sintetaze s delecijama C-terminalne regije
(Genetic and biochemical analysis of mutant seryl- tRNA synthetases with deletions of C-terminal region)

Autori
Gumbarević, Darko

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
29.04

Godina
2008

Stranica
74

Mentor
Weygand-Đurašević, Ivana

Neposredni voditelj
Močibob, Marko

Ključne riječi
seril-tRNA-sintetaza ; C-terminalni produžetak ; Saccharomyces cerevisiae ; pročišćavanje proteina ; metoda pomaka u gelu
(seryl-tRNA synthetase ; C-terminal extension ; Saccharomyces cerevisiae ; purification of proteins ; electrophoretic mobility shift assay)

Sažetak
Cilj ovog rada bio je konstruirati i pročistiti mutant kvaščeve seril-tRNA-sintetaze s delecijom bazičnog produžetka od 13 aminokiselina na C-kraju radi biokemijskih analiza, te ispitati utječe li delecija C-terminalnog produžetka na funkcionalnost enzima in vivo. Gen za krnji protein je umnožen lančanom reakcijom polimeraze, ugrađen u plazmid pCJ11 pod kontrolom GAL1 promotora, te nadeksprimiran u Saccharomyces cerevisiae. Pročišćavanje prekomjerno dobivenog SerRSΔ C13 iz staničnog ekstrakta obavljeno je kromatografijom na ionskim izmjenjivačima FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) sustava. Nakon pročišćavanja enzima određeni su kinetički parametri (Km i kcat), koji nisu pokazivali odstupanja kinetičkih parametara enzima divljeg tipa. Metodom pomaka u gelu dokazano je da krnji protein kvaščeve seril-tRNA sintetaze, te odgovarajući krnji proteini citosolne seril-tRNA- sintetaze kukuruza, stvaraju komplekse s in vitro transkriptom tRNASer na poliakrilamidnom gelu, te da nisu izgubili sposobnost vezanja tRNA. Pokazano je da navedeni proteini stvaraju komplekse u smjesi s ukupnom kvaščevom tRNA na poliakrilamidnom gelu. Radi analize mutanata SerRS∆ C13 i SerRSC∆ C20 in vivo, konstruirani su vektori pUN100SES1Δ C13, pUN100SES1Δ C20 te pUN100SES1 s mutiranim genima pod kontrolom izvornog promotora i terminatora transkripcije gena SES1. Soj kvasca BR2727 koji sadrži inaktivirani kromosomski gen SES1 i ″ rescue″ plazmid pUN70SES1 (sa Ura3 genom) transformiran je navedenim plazmidima. Stanice su uzgajane u Ura+ neselektivnom mediju da bi povećali vjerojatnost izbacivanja pUN70SES1 plazmida, detekcija Ura- stanica je izvršena na 5-FOA Ura+ mediju. Potencijalni pozitivi su provjereni PCR-om i Western analizom. Pokazano je da SerRSΔ C13 može nadomjestiti SerRSwt i omogućiti nesmetan rast stanice.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Kemija, Biologija

POVEZANOST RADA