ࡱ> Y bjbjWW ==]zzzzzTdzg2$ "E"^2l WzzZna~enje citogenetike u klini~koj praksi i istra`ivanju Nina Canki-Klain Kratak opis sadr`aja predavanja i seminara Kako bi se omogu}ilo razumijevanje razli- ~itih citogenetskih tehnika (pruganja, dinami~ ke tehnike obradom BrdU-om) i molekularno citogenetskih tehnika (FISH, li~enje kromosoma, kromosomsko mikroseciranje) u uvodnom predavanju se prikazuje sastav i ure- |enje kromosoma te uloga centromera, telomera i izvora replikacije koji odre|uju biolo{ ke funkcije kromosoma. Slijedi izlaganje odnosa transkripcijske aktivnosti i kromosomske gra|e (fakultativni i konstitutivni kromatin) te se obja{njavaju posebni mehanizmi koji omogu}uju pravilno gensko izra`avanje dva razli~ita spolna kromosoma (pseudoautosomsko podru~je, inaktivacija X-kromosoma, imprinted geni). Useminarskom dijelu polaznici analiziraju znanstveni doprinos i prakti~no zna~enje u medicini citogenetskih i citogenetskih molekularnih tehnika na izabranim vlastitim klini~ kim primjerima: 1) lociranjeDMDgena na X-kromosomu; 2) mehanizam djelovanja kromosoma (slu~aj prstenastog kromosoma, paracentri~na inverzija i spontani poba~aji, paracentri~na inverzija i numeri~ke kromosomske anomalije, slo`ena obiteljska translokacija i sterilnost mu{kih nosioca; 3) odnos fenotip-genotip u anomalija spolnih kromosoma i autosoma;4) analiza djelomi~ne i potpune mole hidatidoze i triploidija; 5) rje{enje marker kromosoma; 6) animalna citogenetika i evolucija kromosoma. GRA\A I FUNKCIJA KROMOSOMA Razli~iti postupci koji obuhva}aju denaturaciju i/ili enzimsku digestiju kromatina nakon ~ega slijedi spajanje s DNA-specifi~ nom bojom, mogu uzrokovati na mitotskim kromosomima slo`enih organizama pojavu popre~nih svijetlo i tamno obojenih pruga (Sl.1 X-kromosom). Pruganje odra- `ava varijacije u uzdu`noj gra|i kromatida. Svaka kromatida mo`e se smatrati nizom pravilno slo`enih kolutova pri ~emu se svaki kolut razlikuje od susjednog po sastavu baza, vremenu kopiranja, gra|i kromatina, kao i po gusto}i gena i ponavljaju}ih nizova. Takva prugavost kromosoma osim {to dopu{ta to~no prepoznavanje svakog pojedinog kromosoma (slika 2 : 47, XYY-R-pruge) omogu}uje detaljnije utvr|ivanje mjesta loma na kromosomu u slu~aju razli~itih strukturnih kromosomskih preinaka (poput: inverzija, (Sl. 3 inv 9) delecija (Sl. 4 del11p), insercija, translokacija (Sl. 5 t(5;17), prstena). Harnden i Klinger (1985) definiraju kromosomsku prugu kao uzdu`nu promjenu u osobinama bojenja nekog kromosoma, koja se mo`e razlikovati od susjednih, dijelova svojim tamnijim ili svijetlijim izgledom. Ra{~lanjivanje u pruge (banding resolution) se ozna~ava brojem pruga koje se vide na jednom haploidnom setu t.j. na 23 kromosoma, od kojih 22 kromosoma predstavljaju jedan od 22 para autosoma, a tre}i je kromosom X. Broj pruga uvelike ovisi o du`ini ili zgusnu}u kromosoma. Metafazni kromosomski preparati koji se upotrebljavaju u rutinskom radu prikazuju u prosjeku 400- 450 pruga po haploidnom setu. Broj pruga se znatno pove}ava na preparatima visokog 29 ra{~ljanjivanja (high-resolution banding), {to se mo`e posti}i produ`enjem kromosoma tj. pripremom prometafaznih umjesto metafaznih kromosomskih preparata. Tipi~no visoko ra{~lanjivanje u pruge u slu~aju kromosoma ~ovjeka mo`e ukupno razlu~iti 550- 850 pruga haploidnog seta, premda postoje opisi i do 1250 pruga. Broj pruga mo`e se procijeniti na vi{e na~ina: brojenjem pruga pojedina~nog kromosoma svakog kromosomskog para u nekoj mitozi, {to ne dolazi u obzir u dnevnoj praksi. Osim toga postoje brojni drugi na~ini (vidi Verma, 1995). Kariogramom nazivamo mikrofotografski prikaz svih kromosoma jedne stani~ne jezgre (Sl.6 A), koji su poredani u parove od 1-22 autosoma i par spolnih kromosoma (Sl. 6 B). Kariotip ozna~uje broj, veli~inu, oblik i kromosomski spol neke osobe npr: 46, XX (normalni enski nalaz) ili 46, XY(normalan nalaz za mu{ku osobu). (tablica1) Pojava kromosomskih pruga-heterokromazija Za G-pruge (Sl.7) je ve} dugo poznato da se kasno repliciraju i da sadr`e relativno visoko kondenzirani kromatin, dok se Rpruge (Sl.6 ) obi~no repliciraju rano u S fazi i imaju manje zbiti kromatinski sastav. Kasno repliciraju}a, vrlo kondenzirana DNA je relativno transkripcijski inaktivna, a za gene se zna da se okupljaju ve}inom u R-prugama. Osnova gra|e razli~itih pruga tek je nedavno razja{njena. Dugo se pretpostavljalo da su G-pruge bogate GC-om. Quinacrine koji daje izgled Q-pruga (Sl.1, QFQ) prvenstveno se ve`e na dijelove DNA bogate AT-om, dok se izgled R-pruga mo`e dobiti bojadisanjem kromomicinom koji se prvenstveno ve`e na dijelove DNA bogate GC-om. Me|utim danas se zna da je DNA G/Q pruge ~ovjeka samo za nekoliko postotaka bogatija sadr`ajem AT-a nego DNA Rpruge. Genom ~ovjeka mo`emo smatrati mozaikom dugih dijelova DNA homogenog sastava izohore, koje se obzirom na sadr`aj guanin-citozina (GC) mogu podijeliti na pet obitelji. Pribli`no 62% genoma otpada na dvije obitelji koje su siroma{ne GC-om (L1 i L2, zajedni~ki nazvane L-obitelj). Oko 35% genoma ~ine tri obitelji koje obiluju GC-om (H1, H2 i H3). Na H1 otpada oko 22%, na H2 9%, a na H3 3-4% genoma, koji predstavlja satelitska i ribosomska DNA. Sadr`aj gena prati koli~inu GC (budu}i da GC predstavlja molekularnu frakciju guanina i citozina u DNA), {to zna~i da izohore siroma{ne GC-om imaju nisku koncentraciju gena te da se njihova koncentracija pove}ava u izohorama koje sadr`e vi{e GC. Zahvaljuju}i in situ hibridizaciji fragmenata DNA koji pripadaju razli~itim obiteljima izohora, dobivena je informacija ne samo o odnosu izme|u izohora i kromosomskih pruga ve} i o raspodjeli gena na kromosomima. Istra`ivanja su pokazala, da najja~u koncentraciju signala nakon in situ hibridizacije fragmenata DNA koji su potjecali iz H3 izohora daju dvije uglavnom podudarne podvrste R-pruga (odnosno negativnih G-pruga). Te dvije podvrste su: 1) T (telomerne)-pruge (Sl. 1, THA ) najotpornije od R-pruga na denaturaciju toplinom, te 2) Kromomicin A3 pozitivne, odnosno DAPI negativne pruge koje su GC-om najbogatije pruge ljudskih kromosoma. Kromosomski smje{taj izohornih obitelji: L1 i L2 te H1 i H2 je pokazao da T-pruge osim {to sadr`e H3 izohore imaju jo{ H2 i neke H1 izohore. Nadalje se ustanovilo, da se R-pruge (tj. R-pruge bez telomernih) sastoje u prosjeku od iste koli~ine H1 i L izohora, dok su H2 iH3 izohore bile rijetko prisutne. G-pruge sadr`e uglavnom L izohore, dok su H1 izohore prisutne u malim koli~ inama. Istra`ivanja Saconea i sur. (1996) su pokazala, da postoji 28 pruga koje hibridizaci- 30 jom daju jak signal i koje se mogu nazvati T ili H3; nadalje, 31 R-pruga, koje su nazvane T ili H3* sadr`e H3 izohore iako u manjoj koncentraciji od H3+; preostalih oko 140 pruga (od 200 pruga pri rezoluciji od 400 pruga) koje su nazvaneRili H3 ne sadr`e H3 izohore. Sve H3+ i H3* pruge sadr`e izohore koje su najbogatije genima u genomu ~ovjeka. Postojanje tri razli~ite podgrupe R-pruga podr`avaju nadalje: 1. razli~ite karakteristike sastava gena koji se u njima nalaze 2. niska gusto}a gena na kromosomima 13 i 18 na kojima su sve R-pruge H3- pruge 3. sastavna karta H3+ pruge Xq28 i H3- pruge 21q11.2 4. prevladavanje dugih (50 kb) nizova bogatih GC-om u H3* / H3 prugama te GC-siroma{ nih u H3-/ G-prugama 5. veliki stupanj podudarnosti H3+ i H3* pruga s prugama koje sadr`e CpG otoke. Ta zapa`anja nam omogu}uju da razumijemo uzrok pojave kromosomskih pruga (heterokromazije) i omogu}uju klasifikaciju kromosomskih pruga, koja se odnosi na sadr` aj GC (i koncentraciju gena). Isto tako potrebno je naglasiti da su ta zapa`anja pro{irena na genome drugih sisavaca. Kromosomska karta koja se osniva na molekularnom sastavu predstavlja novi pristup izu~avanju organizacije genoma na kromosomskoj razini {to je omogu}ila in situ hibridizacija odlomakaDNArazli~itih obitelji izohora. Karta molekularnog sastava kromosoma pru`a detaljniju informaciju o podru~ jima humanog genoma {to najbolje ilustriraju najnovija istra`ivanja podru~ja Xq28 i podru~ja 21 cen-21q21. Uz pomo} 36 umjetnih kromosoma kvasca (YACs) koji su gotovo u potpunosti pokrili 8 Mb DNA dugu terminalnu prugu na dugom kraku X kromosoma ~ovjeka Xq28, napravljena je karta sastava te pruge i ustanovljena su tri podru~ja: proksimalno 3,5 Mb veliko podru~je sastavljeno od L obitelji siroma{nih GC te H2 izohore bogate GC-om srednje podru~je od 2,2 Mb koje ~ini uglavnom H2 izohora bogata GC te H3 izohora vrlo bogata GC-om koje su odvojene L izohorom siroma{nom GC-om, a YAC s toga podru~ja karakterizira izrazita heterogenost gra|e i nestabilnost Distalno 1,3 Mb veliko podru~je ~ine isklju~ ivo L izohore siroma{ne GC-om. Kao {to se i o~ekivalo koncentracija gena i CpG otoka su se pove}avali s pove- }anjem vrijednosti GC izohora. Podru~ je 28 na dugom kraku X- kromosoma (Xq28) slu`i kao primjer podgrupe Rpruga koje se razlikuju od druge dvije podgrupe tj. od T-pruga koje karakteriziraju specifi~ne citogenetske karakteristike i prevladavanje H2 i H3 izohora i od ve}ine R pruga koje ne sadr`e H2 i H3 izohore. Drugi primjer se odnosi na pericentromeri~ no i proksimalno podru~je kromosoma 21 (21cen-21q21). Sastav centromere i subcentromeri~nog podru~ja se ustanovio odre|ivanjem sadr`aja GC-a iz 11 umjetnih kromosoma kvasca koji su pokrivali 13-14 Mb veliko podru~je, koje se prote`e od satelitskih nizova centromerne pruge q11.1 preko R pruge q11.2 do proksimalnog dijela G-pruge q21. Cijelo podru~je ~ine izohore sastavljene od L tj. siroma{ne GC-om i samo jedna izohora H1 bogata GC-om veli- ~ine 2 Mb i smje{tena u q21 pruzi. Gotovo istovjetan sastav GC u satelitskim ponavljanjima centromere (38,5%), R pruge q11.2 (38-40%) daje direktan dokaz da osnovni sastav ne mo`e biti jedini razlog za citogenetske razlike izme|u C, G i ve}ine R pruga tj. H3- R-pruge (koje ne sadr`e H3 izohore). Dobiveni rezultati tako|er pokazuju da izohore mogu biti duge do 6 Mb barem u podru~jima genoma koja su siroma{ na GC-om te podr`avaju prija{nja zapa` anja koja su navodila da su YACs iz izohornih grani~nih podru~ja nestabilna i da ih je te{ko klonirati. U ispitivanom podru~ju siroma{nom GC-om, geni i CpG otoci su vrlo rijetki. 31 METODE KROMOSOMSKIH PRUGA Na osnovi raznih postoje}ih tehnika, mogu} e je razlikovati pet tipova kromosomskih traka: Q,C,G,R,T (Sl. 1). Suplement Pari{ke nomenklature (1975) dao je kd koji opisuje tehnike i na~in bojenja. U tom kodu od tri slova prvo ozna~uje tip obilje`avanja, drugo op}enito upotrebljenu tehniku i tre}e boju. Npr.: Q Q-pruge (Q-banding) kromosomi su obojeni fluorescentnom bojom (quinacrine, DAPI/4, 6-diamidino-2- phenylindole/ ili Hoechst 33258) koja se prioritetno ve`e na dijelove DNA bogate ATom i koja se gleda pod UV fluorescencijom. Fluorescentne pruge se nazivaju Q-pruge i ozna~uju iste segmente kromosoma kao i G-pruge QF - fluorescentne pruge QFQ - fluorescentne Q-pruge obojene quinarcinom QFH - fluorescentne Q pruge obojene Hoechstom 33258 G G-pruge (G-banding) Prije bojadisanja Giemsom- kemijskom bojom koja se ve`e naDNAkromosomi su izlo`eni kontroliranoj digestiji tripsinom. Tamne pruge su poznate kao G-pruge, a svijetle pruge su G-negativne. GT G-pruge obra|ene tripsinom GTG G-pruge obra|ene tripsinom i obojene Giemsinom otopinom GTL G-pruge obra|ene tripsinom i obojene Leishmanovom bojom GAG G-pruge obra|ene otopinom soli octene kiseline i Giemsom C C-pruge- (C-banding) vjeruje se da te pruge pokazuju konstitutivni heterokromatin. Kromosomi se obi~no denaturiraju zasi}enom otopinom barijevog hidroksida prije bojadisanja Giemsom. CB C-pruge nakon obrade barijevim hidroksidom CBG C-pruge nakon obrade barijevim hidroksidom i bojenja Giemsom R R-pruge-(R-banding) u su{tini obrnutog /Reverse/ izgleda od G-pruga. Prije bojadisanja Giemsom kromosomi se denaturiraju toplinom u odre|enoj otopini vode i soli. Obrada toplinom denaturira DNAbogatu AT-om, a R-pruge odgovaraju negativnim Q-prugama. Isti izgled se mo`e posti}i CG-specifi~nim kromomicin bojama poput: chromomycina A3, olivomycina ili mithramycina. RF fluorescentne R-pruge RFA fluorescentne R-pruge obojene naran~astim akridinom RH R-pruge nakon denaturacije toplinom RHG R-pruge nakon denaturacije toplinom, obojene Giemsom RB R-pruge nakon obrade BrdUom RBG R-pruge nakon obrade BrdUom i bojenja Giemsom RBA R-pruge nakon obrade BrdUom i bojenja naran~astim akridinom T T-pruge (T-banding) ozna~uju podgrupu R-pruga koja je naro~ito zgusnuta u telomerama. T-pruge se najja~e bojadi{u od svih R-pruga, a dobivaju se upotrebom naro~ito visoke temperature prije bojadisanja Giemsom ili kombinacijom boja i fluorokroma. TH T-pruge nakon denaturacije toplinom THG T-pruge nakon denaturacije toplinom, obojene Giemsom THA T-pruge nakon denaturacije toplinom, obojene naran~astim akridinom Standardizacija u humanoj citogenetici i ozna~avanje kromosomskih pruga bili su predmet Pari{ke nomenklature (1971). Prema toj nomenklaturi svaki je kromosomski krak podijeljen u podru~ja koja se dijele u pruge, a ove opet u podpruge, ne vode}i ra~una o intenzitetu bojenja koje ovisi o upotrijebljenoj tehnici. Idu}i centrifugalno od centromere na dugi (q) i kratki (p) krak, brojevi odre|uju podru~ja, pruge i podpruge. Pobolj{anje analize strukture kromatida omogu}ilo je pove}anje zapa`enih djeli} a kromosoma od 322 (Pari{ki kongres, 1971) do blizu 450 (Prieur i sur. 1973), zatim 32 606 (Skovby, 1975), vi{e od 650 (Dutrillaux, 1975), 783 (Francke i Oliver, 1978) do preko tisu}u (Yunis, 1976). Bilo koju to~ku na kromosomu definiraju: 1. broj kromosoma 2. slovo p (ako se radi o kratkom kraku) q (ako je u pitanju dugi krak) 3. broj podru~ja 4. broj pruge te eventualno podpruge Primjerice to~ka na Xq211 (slika 8) odgovara mjestu na dugom kraku X-kromosoma u podru~ju 2, pruzi1 i podpruzi 1. @elimo li ozna~iti bez upotrebe podpruga jedno mjesto unutar pruge, mo`emo ocijeniti njenu relativnu udaljenost u odnosu na proksimalni rub pruge. Gore navedeni primjer tako bismo ozna~ili Xq2100. nadalje, neku to~ku smje{tenu na 4/10 udaljenosti od tog ruba izrazili bismo: Xq2104. HETEROKROMATIN Izraz heterokromatin uveo je u citogenetsku terminologiju Heitz (1928) kako bi ozna~ io dio jezgrina kromatina koji ostaje kondenziran za vrijeme interfaze. Mo`emo ga jednostavno definirati kao :"malu frakciju kromatina, koji ne slijedi isti ciklus "kondenzacije- dekondenzacije" kao ostali dio kromosomskog materijala, {to se o~ituje razlikom primanja boje". Heterokromatin se mo`e podijeliti u dvije frakcije: 1. Konstitutivan ili strukturni heterokromatin ,t.j. nepromjeljiv i kona~an, koji zaprema dijelove autosomnih kromosoma i koji se pona{a jednako u oba homologa jednog para autosoma. 2. Fakultativan heterokromatin, koji je nastao na reverzibilan na~in tokom evolucije organizma. Koliko danas znamo, fakultativan heterokromatin odgovara djelomi~noj inaktivaciji jednog od dva X-kromosoma u osoba s 46, XX kromosoma i uzrok je stvaranju spolnog kromatina (slika 9). Njegova fiziolo{ ka svojstva su: Kasno umna`anje DNA tokom stani~- nog ciklusa t.j. razli~ito vrijeme replikacije u odnosu na vrijeme aktivnog Xkromosoma i autosoma Relativna genska inaktivnost-transkripcija se malo ili nikako ne pojavljuje Razli~ita kondenzacija za vrijeme interfaze (heteropiknoza ili svojstvo alociklije) POLO@AJNI U^INAK I TRANSLOKACIJE X-AUTOSOM Polo`ajni u~inak position effect je definiran kao vi{e ili manje slo`ena ali uravnote` ena kromosomska preinaka koju prate anomalije fenotipa. Pojam je uveden u geneti~ ku terminologiju povodom lokusa Bar, kada se eksperimentalno moglo dokazati da gensko djelovanje mo`e ovisiti o okolini u kojoj se gen nalazi, tj. o polo`aju gena u odnosu na druge gene na kromosomu. Ovaj pojam obuhva}a dvije velike grupe, vjerojatno, razli~itog mehanizma djelovanja: Efekt pozicije stabilnog tipa - kromosomski lom se nalazi unutar regije koja sadr` i fiziolo{ki srodne gene. Fenotip je isti za sve stanice, tj. stabilan je (npr. lokus Bar). Efekt pozicije{arolikog tipa ili variegation anglosaksonskih autora, nastaje uslijed istodobnog loma kromosoma u eukromatinskom i heterokromatinskom podru~ju. Ukr{teno spajanje lomnih to- ~aka dovodi eukromatsko podru~je u dodir s heterokromatinskim, koje inhibira gensku aktivnost u nekim, ali ne svim stanicama, {to se o~ituje pojavom mje{ovitog fenotipa sastavljenog od mozaika normalnog i promijenjenog tkiva. Kako pozicijski u~inak {arolikog tipa najvjerojatnije odgovara promjenama replikacije koje su se zamijetile uglavnom u sterilnih ena s translokacijom X-autosom, {to se zorno moglo prikazati zahvaljuju}i di- 33 nami~kim kromosomskim tehnikama (Sl.8), iznijet }u nekoliko hipoteza na tu temu: Polo`ajni u~inak se mo`e djelomi~no objasniti heterokromatizacijom translociranih segmenata na X-kromosom. Ispitivanja na modelu mi{a, kako razli~iti prijelomi unutar X-kromosoma djeluju na supresiju djelovanja odre|enih gena, su pokazala da svi segmenti X-kromosoma nemaju supresivnu aktivnost. Inaktivacija polazi iz jedne danas to~no lokalizirane to~ke i {iri se vi{e ili manje odre|enim dijelom X-kromosoma.U slu~aju translokacije dijela nekog autosoma na X-kromosom inaktivacija heterokromatinskog X-kromosoma {iri se na gene autosoma, koji su do{li u direktan kontakt s tim X-kromosomom. S druge strane je dosta vjerojatno da su geni autosoma razli~itih funkcija razli~ito osjetljivi na djelovanje te inaktivacije. U~inak polo`aja {arolikog tipa, koji se opazio u mi{a prilikom recipro~nih translokacija izme|u autosoma i X-kromosoma uvjetovan je koli~inom X-kromosoma, a ne spolom jedinke, budu}i da enke, koje nose translokaciju a imaju samo jedan Xkromosom ne pokazuju {arolikost. Opisani fenomen bi odgovarao normalnoj inaktivaciji jednoga od dva X-kromosoma. Danas znamo, da ta inaktivnost polazi iz jedne to~no lokalizirane to~ke- X-inaktivacijskog centra (Xic), koji se u ljudi nalazi u blizini centromere na dugom kraku X-kromosoma : Xq13. Proces inaktivacije zapo~inje gen XIST ( X- inactivation specific transcript) samo inaktivnog X-kromosoma, koji kodira 15 kb velik zreli RNA produkt. Na taj na~in XIST slu`i kao primjer gena koji je podlo` an monoalelskoj ekspresiji (tablica 1). Inaktivacija izvr{ava diferencijalnom metilacijom, me|utim mehanizam koji osigurava inaktivaciju gena na inaktivnom X-kromosomu, ali ne i na aktivnom nije poznat. Potrebno je napomenuti, da nije cijeli Xkromosom inaktiviran. Kada bi se to dogodilo, tada nebi postojale razne patolo{ke klini~ke slike koje prate vi{ak ili manjak X kromosoma u oba spola. Prema tome moglo bi se pretpostaviti sljede}e: U slu~aju djelomi~ne inaktivacije jednoga X-kromosoma u osoba s 46, XX bilo bi potrebno da prijelom bude u heterokromatinskom dijelu X-kromosoma koji je normalno inaktivan, kako bi se o~itovao efekt pozicije. Segment autosoma translociran na Xkromosom bio bi inaktiviran razmjerno slu~ajnoj inaktivaciji promijenjenog Xkromosoma. Zatim bi se moglo zamisliti djelovanje selektivnih mehanizama koji bi bili razli~iti u raznim tkivima. [to se ti~e {irenja inaktivacije mo`e se pretpostaviti da ona ovisi o du`ini pripojenog segmenta, tj. o udaljenosti od mjesta supresije. Fragment translociranog X-kromosoma na autosom morao bi po toj hipotezi izbje} i utjecaju supresije, t.j. morao bi biti aktivan. Tablica 1. Mehanizmi koji dovode do monoalelske ekspresije bialelskih gena u stanicama ~ovjeka ( sisavaca) MEHANIZAM MONOALELSKE EKSPRESIJE RELEVANTNI GENI I STANI^NI SMJE[TAJ Isklju~ivanje alela neovisno o roditeljskom porijeklu INAKTIVACIJA XKROMOSOMA Ograni~ava se na odre|ene X-vezane gene samo u ena. U svim stanicama u kojim se geni o~ituju alelska ekspresija potje~e samo od neinaktiviranog X-kromosoma. Isklju~ivanje alela prema roditeljskom porijeklu GENOMSKI OTISAK GENOMIC IMPRINTING Mali broj gena. Stani~ni smje{taj ovisi o tome gdje se odre|eni gen o~ituje, ali je potrebno naglasiti da neki imprinted genes pokazuju u nekim vrstama stanica monoalelsku, a u drugim bialelsku ekspresiju 34 SPOLNI KROMOSOMI @ENE Svaki od dva X-kromosoma u ene ima razli~ito i specifi~no fiziolo{ko pona{anje, na ~emu se zasniva izvjestan broj biolo{kih pretraga ( analiza Barrova tjele{ca (Sl.9), dinami~ ka citogenetska pretraga obradom BrdU-om (Sl.8 i 10) i neko} upotrebljavana autoradiografija, koje su upu}ivale na postojanje mehanizma regulacije X-kromosoma. Neki autori su ve} 1959 pretpostavili vezu izme|u jednog od X- kromosoma ene i stvaranja Barrova tjele{ca. Autoradiografska istra`ivanja pru`ila su prve dokaze u korist ove hipoteze. Po~etkom {azdesetih godina pro{log stolje}a opazilo se, da jedan kromosom iz grupe C u ene pokazuje vrlo intenzivno markiranje, t.j. da ugra|uje vi{e timidina nego bilo koji drugi kromosom. Sli~na zapa`anja razli~itih autora te nalikovanje tog elementa X-kromosomu omogu} ila su zaklju~ak da kromosom s kasnom replikacijom u ene odgovara jednom od dva X-kromosoma. Radi intenzivnog obilje` avanja Anglosaksonci su ga prozvali" topli"( hot), dok su njegove druge osobine doprinijele nazivima: asinhroni-X i X-s kasnom replikacijom. Hipoteza koja povezuje heteropiknozu, Barrovo tjele{ce i kasnu replikaciju DNA s inaktivacijom jednog od dva X-kromosoma u normalne 46,XX ene uglavnom je potvr|ena, iako svi problemi jo{ nisu rije{eni. Kompenzacija sadr`aja X-vezanih gena i njeni mehanizmi regulacije Termin dosage compensation se odnosi na fenomen regulacije na kojem se osniva ekspresija X-vezanih gena u enki i mu`jaka. Istra`ivanjem tog problema otkrivena su do sada tri regulatorna mehanizma: inaktivacija heterokromatizacijom transkripcijska kontrola kromosomska eliminacija Ti razli~iti modeli kompenzacije genskog sadr`aja na{li su se unutar jednog roda (npr. inaktivacija i eliminacija kromosoma u sisavaca), pa ~ak i u istoj vrsti (npr. inaktivacija i kontrola transkripcije u drozofile). INAKTIVACIJA X-KROMOSOMA Pojava kromosomskog mehanizma u determinaciji spola t.j. podjela na heterogametski (XY) i homogametski (XX) spol predstavlja odlu~an momenat u spolnoj diferencijaciji sisavaca. Kako bi taj kromosomski sistem mogao eliminirati u~inke aneuploidije u somaskim tkivima te osigurati diferencijaciju i normalan spolni razvoj, potrebno je da posjeduje regulacijski sistem X-kromosoma koji omogu}uje: 1. Dva aktivna X-kromosoma u zametnom tkivu enke za vrijeme oogeneze 2. Inaktivaciju ili eliminaciju jedinog X-kromosoma u zametnom tkivu mu`jaka u razdoblju koje je vjerojatno kriti~no za spermatogenezu. 3. Jedan aktivan X-kromosom u somatskim tkivima oba spola Lyon-hipoteza Poku{avaju}i na}i rje{enje prije postavljenog problema, Mary Lyon je 1961. predlo` ila hipotezu koja je otvorila novo poglavlje u istra`ivanju X-kromosoma. Autorica je pretpostavila, da rano u razvoju dolazi do slu~ajne inaktivacije jednog od X-kromosoma maj~ina ili o~eva porijekla. Kad se jednom dogodila ta funkcionalna diferencijacija, ona se neopozivo klonalno prenosi tijekom stani~nih dioba. Ta originalna hipoteza, iako je op}enito bila prihva}ena nije navodila niti to~no vrijeme nastanka inaktivacije, niti njen molekularni mehanizam. Evolucija inaktivacije Polaze}i od hipoteze, da su X i Y kromosom u po~etku predstavljali par obi~nih homolognih kromosoma, Lyonova je 1974. predlo`ila evolutivni model inaktivacije 35 X-kromosoma u sisavaca, definiraju}i porijeklo heterogametije u mu`jaka i postanak mehanizma kompenzacije genske koli~ine u sisavaca. Taj bi proces karakterizirao sljede} i niz doga|aja: 1. Stvaranje malog razli~itog segmenta na jednom od spolnih kromosoma (tj. na Y-kromosomu), koji se na po~etku me|usobno ne razlikuju. 2. Inaktivacija spolnih kromosoma za vrijeme gametogeneze mu`jaka, ali potpuna aktivnost oba homologa u zametnim stanicama enke. 3. Premje{tanje velikog dijela prvobitnog Y-kromosoma (koji je homologan istom segmentu X-kromosoma) na X-kromosom. Taj proces bi pratila inaktivacija ~iji bi zadatak bio da sprije~i vi{ak materijala X-kromosoma u somatskim stanicama, uz potpuno odr`avanje aktivnosti oba X-kromosoma u zametnim stanicama enke kao i u mu- `jaka, ali samo u ranom stadiju, dok bi kasnije u ovih potonjih do{lo do potpune inaktivacije. 4. Polagano mijenjanje obiju podvostru- ~enih polovica X-kromosoma mutacijom i selekcijom Rezimiraju}i, i inaktivacija X-kromosoma je proces koji postoji u svih sisavaca, a njen rezultat je selektivna inaktivacija alela jednog od dva X-kromosoma ene. (Migeon, 1994; Lyon, 1999). Taj fenomen pru`a mehanizam koli~inske kompenzacije, koji izjedna~ava razlike me|u spolovima u o~ekivanom odnosu koli~ine autosomskih gena prema koli~ini gena X-kromosoma (koji je 2:1 u mu{karaca, a 1:1 u ena). Mu{karci su s jednim X-kromosomom priro|eno hemizigoti za gene X-kromosoma, ali ene postaju inaktivacijom jednog od roditeljskih alela X-kromosoma funkcionalno hemizigoti. Ne podlije`u svi geni X-kromosoma inativaciji. X-inaktivaciji izmi~u geni ~iji se funkcionalni homolozi nalaze na Y-kromosomu (slika 11) (PAR1=glavno pseudoautosomno podru~je koje zaprema 2.6 Mb telomerno podru~je kratkih krakova X i Y kromosoma; PAR2=manje va`no pseudoautosomno podru~je=zauzima 320 kb telomernog dijela dugih krakova X i Y kromosoma) te neki geni za koje se smatra da njihova koli~ina nije va`na. U osoba s abnormalnim brojem X-kromosoma aktivan ostaje samo jedan X bez obzira koliko ih je jo{ prisutnih. Naprotiv, u slu~aju triploidija jedan ili dva X-kromosoma ostaju aktivna, a u tetraploidijama dva X-kromosoma. Prema tome, mora postojati neki ra~unski mehanizam koji osigurava da jedan X-kromosom ostaje aktivan za svaka dva seta autosoma. U sisavaca su oba X-kromosoma aktivna u ranom razvojnom periodu enskog embrija. X-inaktivacija zapo~inje u mi{a u kasnom stadiju blastule {to je najvjerojatnije slu~aj i u ~ovjeka. U svakoj stanici iz koje }e se razviti enski plod jedan od dva roditeljska X-kromosoma se nasumce inaktivira. Potrebno je naglasiti da stanice trofoblasta predstavljaju iznimku budu}i da se prete`no inaktivira X-kromosom o~eva porijekla, {to predstavlja klasi~an primjer otiska ograni~enog na odre|eno tkivotissue-restricted imprinting (tablica 1). Nakon {to je do{lo do inaktivacije o~evog ili maj~inog X-kromosoma u nekoj stanici isti X-kromosom obi~no ostaje inaktivan u svih potomaka te stanice, {to zna~i da se inaktivacija X-kromosoma naslje|uje na klonalni na- ~in. Prema tome enski sisavci su mozaici sastavljeni od mje{avine stani~nih linija u kojima je inaktiviran X-kromosom o~eva porijekla i stani~nih linija koje sadr`e inaktiviran maj~in X-kromosom. Osim inaktivacije X-kromosoma u enskim somatskim stanicama, poznato je da se kromosom X prolazno inaktivira u vrijeme gametogeneze u oba spola. Hipoteza slu~ajne inaktivacije ima iznimke koje predstavljaju strukturne anomalije X-kromosoma u ene (Canki,1983). Kao op}e pravilo mo`emo zapamtiti, da u slu~aju neuravnote`ene strukturne promjene X-kromosoma (npr. prsten, delecija, izokromosom za dugi krak, neuravnote`ene translokacije X- autosom) dolazi gotovo 36 uvijek do inaktivacije tog X-kromosoma, dok je normalanXaktivan. Nasuprot tome, kada se radi o uravnote`enoj translokaciji X- autosom, u ve}ini slu~ajeva inaktivacija zahva}a normalni X-kromosom (Canki i sur. 1979). Navedeni izuzeci Lyonove hipoteze su za o~ekivati, jer bi inaktivacija normalnog X-kromosoma dovela do stanica s nulisomijom za dio X-kromosoma koji fali u neuravnote`enim strukturnim preinakama X-kromosoma, {to bi vjerojatno dovelo do smrti stanice. Isto tako u slu~aju uravnote` enih translokacija X-autosom inaktivacija translociranog X-kromosoma bi se {irila na translocirane autosomske gene, {to bi dovelo do funkcionalne monosomije. Zbog toga se mo`e pretpostaviti da ta ne slu~ajna inaktivacija proizlazi iz inaktivacije koja je u po~etku slu~ajna, ali koja se kasnije izmijenila stani~nom selekcijom. KROMOSOMSKE ANOMALIJE CITOGENETSKA ANALIZA ILI PRETRAGA KROMOSOMA Kromosome analiziramo u momentu mitoze ili mejoze. Mejotske kromosome dobijamo samo iz gonada, {to zna~i nakon biopsije testisa ili ovarija, i u tom slu~aju govorimo o mejozi. Kada op}enito govorimo o kromosomskoj analizi, mislimo na kromosome u momentu mitoze, tj. ispitujemo kromosome u metafazi i prometafazi. Materijal za kromosomsku analizu mo`e biti: krv, ko`a, gonada, ko{tana mo`dina, trofoblast, stanice amnijske teku}ine, tj. bilo koje stanice koje imaju jezgru budu}i da su u njima kromosomi. Kromosomske nepravilnosti mogu se definirati kao promjene koje dovode do vidljivih kromosomskih promjena. Koliko mo`emo vidjeti ovisi o upotrebljenoj tehnici. Pri upotrebi uobi~ajenih standardnih citogenetskih metoda, tj. pri rezoluciji od 400-500 pruga po haploidnom kariotipu, najmanja vidljiva promjena u obliku gubitka (delecija) ili vi{ka (duplikacija) materijala iznosi oko 5-10 megabaza (Mb) DNA. Zahvaljuju}i tehnikama visokog ra{~lanjivana, koje su se pojavile 1976. i koje razlikuju blizu 850 pruga, mogu}e je uo~iti promjenu veli~ine 2-5 Mb. Te tehnike je lako rutinski upotrebljavati, {to je omogu}ilo otkrivanje velikog broja kromosomskih preinaka. Kako jedna kromosomska pruga mo`e sadr`avati razli~ it broj gena, klini~ke posljedice delecije ovisit }e o funkciji gena koji se nalaze u izgubljenom dijelu. Me|utim, fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) upotrebom tehnika molekularne biologije omogu}ava vidljivost gubitka DNA manjeg od 2 Mb. Razvoj molekularne citogenetike je uklonio jasnu granicu izme|u promjena opisanih kao kromosomske nepravilnosti i promjenama o kojima se razmi{lja kao molekularnim ili DNA anomalijama. Alternativna definicija kromosomske nepravilnosti je nepravilnost koju su na specifi~an na~in izazvali kromosomski mehanizmi. Ve~ina kromosomskih aberacija nastaje neispravnim popravkom slomljenih kromosoma, pogre{nom ponovnim spajanjem ili nepravilnim odvajanjem za vrijeme mitoze ili mejoze. VRSTE, U^ESTALOST I MEHANIZAM NASTANKA KROMOSOMSKIH ANOMALIJA Konstitucijske kromosomske anomalije su prisutne od za~e}a ili nastaju tijekom prvih dioba zigote. Razlikujemo dvije osnovne grupe : 1. Numeri~ke anomalije nastaju zbog nepravilnosti pri oplodnji ili uslijed nepravilne raspodjele kromosoma pri stani~noj diobi 2. Strukturne anomalije, koje su posljedica jednog ili vi{e kromosomskih lomova nakon ~ega dolazi do nepravilnog ponovnog sljepljivanja fragmenata Podaci kojima raspola`emo o u~estalosti kromosomskih anomalija u ve}ini slu~ajeva potje~u iz doba prije upotrebe kromosomskih pruga te zbog toga potcjenjuju broj strukturnih anomalija. Potrebno je naglasiti da o~ito postoji vrlo velika selekcija od za- 37 ~e}a do ro|enja, koja se odnosi na anomalije autosoma s iznimkom monosomije X. Do tih se podataka do{lo na osnovi analize spontanih poba~aja. Ta su ispitivanja pokazala da 15% svih prepoznatih trudno}a zavr{ava poba~ajem u prvom trimestru i da 60% plodova nosi kromosomsku anomaliju. Taj visoki postotak se smanjuje na 5% u kasnim poba~ajima i u mrtvoro|en~adi, da bi u~estalost kromosomskih anomalija pri ro|enju ive novoro|en~adi iznosila od 0,6 do 0,9%. Me|utim, potrebno je naglasiti da je vrsta opa`enih anomalija posebna za svaku od tih populacija (tablice 2 i 3). Naj~e{}e numeri~ke anomalije pri ro|enju predstavljaju anomalije gonosoma: 47, XXX; 47, XXY i 47, XYY (slika 2) (pribi`no 1:1000 ro|enja po odre|enom spolu) i trisomije autosoma (1,4:1000) od kojih najve}i broj otpada na trisomiju 21 (slika 7) (1,2:1000=1:833). Od strukturnih anomalija naj~e{}e su uravnote`ene Robertsonove (0,9:1000) (slika 12) i recipro~ne translokacije (0,9-1,4:1000) (slika 5). Neuravnote- `ene strukturne anomalije su relativno rijetke u op}oj populaciji, ali se ve}inom nalaze u polimalformirane djece s du{evnom zaostalo{}u. Tablica 3. Kromosomske anomalije otkrivene na uzorku spontanih poba~aja (oko 60% otpada na prvi trimestar trudno}e (Turleau C. i Prieur M. www-timc.imag.fr/Olivier. Cohen/ college/Enseignement/genchrom/htm) KROMOSOMSKA ANOMALIJA % Trisomije 52 45,X 18 Triploidije 17 Tetraploidije 6 Drugo 7 Ste~ene, klonalne anomalije se naj~e{}e nalaze u malignim hemopatijama i solidnim tumorima. Kromosomske anomalije su u tim slu~ajevima ~esto mnogo kompleksnije nego u slu~aju konstitucijskih anomalija, budu} i da se ne radi o istim selektivnim ~imbenicima. Numeri~ke kromosomske anomalije Radi se o promjeni broja kromosoma dok im gra|a ostaje normalna. Te anomalijemogu biti homogene, tj. prisutne u svim stanicama organizma ili u mozaiku. Kada su homogene, naj~e{}e se radi o mejotskom nerazdvajanju kromosoma, {to se o~ituje nastankom trisomije (prisutnost prekobrojnog normalnog kromosoma) (slika 2, 7, 10, 13) ili monosomijom (gubitak jednog kromosoma).Utim slu~ajevima govorimo o 38 Tablica 2. U~estalost kromosomskih anomalija pri ro|enju na uzorku od pribli`no 70.000 novoro|en~adi. Upotreba kromosomskih traka srednje ras~lanjenosti (tj. oko 400 pruga) omogu}uje pove}anje procjene na 9:1000, od ~ega 5: 1000 otpada na uravnote` ene preinake. (Turleau C. i Prieur M. www.imc.imag.fr/Olivier.Cohen/college/Enseignement/ genchrom/htm) KROMOSOMSKE ANOMALIJE U^ESTALOST NA 1000 NOVORO\EN^ADI (BEZ PRUGA) ANEUPLOIDIJE (s mozaicima): _ Spolni kromosomi 2,03 od ~ega : Mu{ki spol 2,53 @enski spol 1,50 _ Autosomi 1,45 od ~ega : Trisomija 21 1,21 Strukturne anomalije _ Uravnote`ene 2,12 dont : Robertsonove transl. 0,99 Recipro~ne translok. 0,91 Inverzije 0,22 _ Neuravnote`ene 0,62 dont : Robertsonove transl. 0,06 UKUPNO 6,22 aneuploidiji (suvi{ak ili manjak jednog ili vi{ak kromosoma euploidnog seta) Nerazdvajanje non-disjunction predstavlja nedostatak razdvajanja para homolognih kromosoma koji u anafazi prelaze u istu potomak-stanicu umjesto da svaki odlazi u pojedina~ne nastale stanice. Nerazdvajanje mo`e nastati tijekom mejoze majke ili oca (Sl.2). Mo`e zahvatiti dva homologna kromosoma tijekom prve mejotske diobe ili dvije sestrinske kromatide. U prvom }e slu~aju gameta dobiti po jedan kromosom od svakog od svojih roditelja( maj~in i o~ev) ,dok }e u drugom slu~aju dobiti dva uzorka istog roditeljskog kromosoma (maj~inog ili o~evog). Me|utim te dvijekopije ne}e biti genetski identi~ne zbog rekombinacija koje nastaju na po~etku mejoze. Zahvaljuju}i ispitivanjima polimorfizama DNA mogu}e je u ve}ini slu~ajeva odrediti podrijetlo prekobrojnog kromosoma. Naj~e{}e se radi o kromosomskom nerazdvajanju maj~inog porijekla, a dob majke predstavlja glavni etiolo{ki faktor koji podupire kromosomsko ne razdvajanje (tablica 4). Strukturne anomalije Strukturne anomalije nastaju kao posljedica kromosomskih lomova nakon ~ega dolazi do ponovnog jednog ili vi{e abnormalnih zaljepljivanja. Strukturne anomalije mogu obuhvatiti jedan, dva kromosoma ili katkad vi{e kromosoma; homologne (slika 12 A) ili nehomologne kromosome (slika 12 B). Strukturne anomalije mogu biti uravnote` ene ili neuravnote`ene. Uravnote`ene anomalije nemaju gubitak kromosomskog materijala i obi~no ih prati normalan fenotip. Posebni slu~aj predstavlja kromosomski lom unutar gena odgovornog za odre| enu bolest (Canki i sur.1979) Uravnote`ene anomalije mogu za vrijeme mejoze stvarati neuravnote`ene gamete, ~ijom oplodnjom mogu nastati abnormalne zigote - uzro~nici spontanih poba~aja, ro|enja malformirane i psihomotorno zaostale djece. Takve anomalije mogu nastati iznova (de novo) (slika 4) ili kao posljedica uravnote` ene roditeljske preinake. Delecije (del) Nastaju zbog kromosomskog loma s gubitkom distalnog dijela (terminalne delecije), ili uslijed nastanka dva loma na istom kraku kromosoma i gubitkom segmenta izme|u lomova (umetnuta delecija)(slika 4). Prstenasti kromosomi (r) Nastaju zbog loma kromosoma na oba kraja, koji se zatim slijepe uz gubitak distalnih dijelova. Prstenaste tvorevine bi na 39 Tablica 4. Prevladavaju}e roditeljsko porijeklo pri nastanku numeri~kih anomalija: ve}ina autosomskih trisomija nastaje u mejozi majke (Turleau C. i Prieur M. www-timc.imag.fr/ Olivier.Cohen/college/Enseignement/genchrom/htm) majka mejoza I mejoza II otac Trisomija 21 93% 75% Trisomija 13 88% Trisomija 14 83% Trisomija 15 88% Trisomija 18 93% 60% Trisomija 16 _ 100% ~100% 47,XXX 90% 75% 47,XXY 53% 47% 47,XYY 100% 45,X 80% prvi pogled mogli smatrati dvostrukim delecijama. Me|utim, mitotske izmjene sestrinskih kromatida stvaraju slo`ene izvedene kromosome s umno`enim i manjkavim segmentima, {to ote`ava interpretaciju klini~ ke slike bolesnika. Inverzije(inv) Nastaju zbog dva loma na istome kromosomu pri ~emu se isje~en fragment nakon preokretanja ponovo zalijepi za ostatke istog kromosoma. Unutar kromosomskih inverzija razlikujemo dvije vrste: pericentri~ ne ako se u izvrnutom segmentu nalazi centromera (slika 3) i paracentri~ne, ako se oba loma nalaze na istom kraku kromosoma (slika 14). Inverzije su uravnote`ene kromosomske preinake, ali u mejozi dovode do pote{ko}a pri spajanju kromosoma u parove. Naj~e{}e dolazi do stvaranja petlje pri sparivanju. Izmjena kromatida u izvrnutom (invertiranom) segmentu dovodi do stvaranja abnormalnih gameta koje sadr`e kromosome s podvostru~enim i manjkavim dijelovima. [to su ti segmenti ve}i, ve}a je smrtnost te je vrlo mali rizik za ro|enje malformiranog djeteta sposobnog za ivot. U slu~aju paracentri~nih inverzija (Sl.14) segmenti s podvostru~enjima i dijelovima koji fale sadr`e centromeru. Rekombinacija dovodi do stvaranja dicentri~nih ili acentri~ nih kromosoma, tj. vrlo nestabilnih formacija koje imaju vrlo malu vjerojatnost za stvaranje zigote sposobne za ivot. FISH U PRAKSI U dvadesetipet godina potvr|ena je klini~ ka uloga kromosomske analize u dijagnostici genetskih bolesti i u procjeni kromosomskih anomalija koje su povezane s rakom. Osim toga razvoj razli~itih citogenetskih metoda omogu}io je otkri}a na podru~ ju evolucije ~ovjeka, pridonio obja{njenju mehanizama nastanka razli~itih kromosomskih anomalija (aneusomie de recombinaison; mehanizam djelovanja prstenastih kromosoma), obja{njenje nastanka jednojaj~ anih blizanaca s razli~itim kariotipom (monozigoti-heterokarioti) te dao veliki doprinos u smje{taju gena na kromosomima. Zahvaljuju}i citogenetskoj analizi standardnoj ili s visokim razlu~ivanjem, sveukupna analiza stani~nog genoma omogu}ava otkri} e genomskih i kromosomskih mutacija. Ta analiza omogu}ava to~nu i brzu morfolo{ ku dijagnozu mutacija reda veli~ina od 5-10 milijona parova baza /pb/. Manje kromosomske preinake koje obuhva}aju manje od milijom parova baza je te{ko ili nemogu} e otkriti upotrebom konvencionalnih citogenetskih tehnika. Osim toga, kromosomski markeri, te novo nastale neuravnote` ene translokacije, kromosomske anomalije koje ne mijenjaju slijed kromosomskih pruga kao i kromosomske preinake opa`ene u kanceroznim stanicama ostaju najve}i citogenetski problem. Jedna od nepovoljnih strana konvencionalne citogenetske analize je potreba za analizom stanica koje se aktivno dijele. Zbog toga je potrebno ulo`iti mnogo vremena i rada kako bi se dobilo dovoljno velik broj stanica za analizu. Osim toga selekcija stanica mo`e povremeno utjecati na rezultat takvih ispitivanja, budu}i da stani~ni rast in vitro ne mora potpuno odgovarati izvornoj stani~noj populaciji. Velik broj od navedenih problema mo`e rije{iti fluorescentna in situ hibridizacija (FISH). Ta razmjerno nova tehnologija dodatak je konvencionalnoj citogenetici jer istovremeno pru`a molekularne i citogenetske rezultate. Osim toga, dijagnozu mo`emo dobiti za 24, 48 sati, {to je znatno manje u odnosu na vrijeme potrebno za konvencionalnu citogenetiku ili za molekularne tehnike koje se upotrebljavaju za otkrivanje promjera u nizovima DNA. Odre|ene poreme} aje koje prate submikroskopske preinake ili skrivene (kripti~ne) translokacije mnogo je lak{e otkriti s FISH-om nego s bilo kojom drugom tehnikom. Na taj je na~in mogu}e mnogo ranije ustanoviti rizik ponavljanja poreme}aja. 40 41 Slika 1. Oblik i ozna~avanje X-kromosoma (vidi tekst) Slika 2. Kariogram mu{karca s 47,XYY kromosoma prikazan R-prugama. 42 Slika 3. Pericentri~na inverzije kromosoma 9. a) homogeno obojani normalan i invertiran kromosom 9 prikazani klasi~nom tehnikom; b) prikaz R-prugama; c) shematski prikaz nastanka anomalije; d) prikaz G-prugama; e) C-pruge intenzivno crno prikazuju heterokromati~ na podru~ja centromera i polimorfnog heterokromatina koji se nalazi na dugim krakovima kromosoma Slika 4. Umetnuta delecija na kratkom kraku kromosoma 11. Strelice na normalnom kromosomu prikazuju to~ke loma i segment koji fali na drugom kromosomu 11. Kromosomi su prikazani R i G-prugama. Bolesnik s aniridijom, anomalijama spola i du{evnom zaostalo{} u 43 Slika 5. Prikaz uravnote`ene translokacije izme|u dugog kraka kromosoma 5 i dugog kraka kromosoma 17. Horizontalne strelice pokazuju to~ke loma. Indikacija za citogenetsku pretragu su bili spontani poba~aji 44 Slika 6. Kariotip normalne ene 26, XX. A) Izgled kromosoma pod mikroskopom; B) Kariogram prikazan u R-prugama Slika 7. Prikaz kromosoma djeteta sa slobodnom trisomijom 21. A) Izgled kromosoma pod mikroskopom. Strelice ozna~uju tri kromosoma 21. B Kariogram mitoze A prikazan G-prugama 45 Slika 9. Izgled Barrova tjele{ca iz ~etiriju razli~itih jezgara bolesnica s anomalijama X-kromosoma. Slika 8. A) Kariogram 25-godi{nje ene s primarnom amenorejom i uravnote`enom translokacijom: 46,X, t(X;17) (p21; q22). Dinami~na tehnika obradom bedoksiuridinom (BrdU-om) (RBA tehnika) pokazuje aktivni translocirani X-kromosom. Strelice ozna~uju translocirane kromosome X i 17. Zvjezdica ozna~uje normalan u svim analiziranim stanicama inaktivni X-kromosom. B) Monta`a translokacije: a) u RHG tehnici; c) u RBA tehnici; b) shema preinake 46 Slika 10. Kariotip 21-godi{nje du{evno zaostale ene : 48, XXXX u RBA tehnici. Strelice ozna~uju X-kromosome s kasnom replikacijom, a zvjezdica rano repliciraju}i X. Slika 11. Shematski prikaz pseudoautosomnih podru~ja PAR1 na telomernom dijelu kratkog kraka kromosoma X i Y te podru~ja PAR2 na telomernom dijelu dugog kraka kromosoma X i Y 47 Slika 12. Robertsonova translokacija. A) dva homologna kromosoma zdrave ene sa sedam spontanih poba~aja. Kariogram 45, XX,t(13q13q) prikazan R-prugama. Postoji 100% rizik za abnormalni plod koji }e imati monosomiju 13 (poba~aj) ili trisomiju 13 (~esto poba~aj ali i vrlo malformirana ivoro|en~ad koja ubrzo umiru). B) dva nehomologna kromosoma zdrave ene s dva spontana poba~aja. Osim rizika za pojavu trisomije 13 i poba~aj radi trisomije 14 postoji mala opasnost pojave trisomije 21 do koje dolazi uslijed poreme}ene kromosomske ravnote`e Slika 13. Kariotip 47, XXX otkriven prenatalnom dijagnostikom; R-pruge. Strelice ozna~uju normalna tri X -kromosoma 48 Slika 14. Slu~ajno otkrivena paracentri~na inverzija kromosoma 7 bolesnice s Turnerovim sindromom: 45, X, inv(7)b (q113q223). A) lijevo normalan, a desno preina~en kromosom prikazani R-prugama; u sredini shematski prikaz anomalije; B) kariogram bolesnice prikazan R-prugama. Strelica ozna~ ava invertirani kromosom 7 Slika 15. A) G-pruge; B) R-pruge preina- ~enih kromosoma 2 i 22 u djeteta s CATCH 22 sindromom (Cardiac defect, Abnormal facies, Thymus hypoplasia, Cleft palate, Hypocalcemia, chromosome 22) i neuravnote- `enom translokacijom 45,XX,-2,-22,+der(2), t(2;22)(p252;q112)de novo 49 Slike 16 i 17. Prikaz FISCH analize uz pomo} kozmid sondi Sc11,1 i 3F4 koje su smje{tene u Di Georgeovom podru~ju. Signal postoji samo na normalnom kromosomu 22, {to zna~i da delecija kromosoma 22, koji je translociran na kromosom 2 (der 2) obuhva}a cijelo DiGeorge podru~je koje obi~no fali. 50 Slika 17. Literatura 1. Heitz E. Das heterochromatin der Moose. Jahrb Wiss Bot 1928;69: 762-818 2. Clark M.S., Wall W.J. Chromosomes. The Complex code. Chapman & Hall, London 1996. 3. Verma R.S., Babu A. A Human chromosomes. Principles and techniques. 2nd ed. McGraw-Hill, Inc, New York, 1995. 4. ISCN 1958, Cytogenetics, Karger, 1985. 5. Dutrillaux B. Sur la nature et lorigine des chromosomes humains. LExpansion Scientifique, Paris 1975. 6. Migeon BR.X-chromosome inactivation: molecular mechanisms and genetic consequences. Trends Genet 1994; 10: 230-235 7. Lyon MF:X-chromosome inactivation. Curr Biol 1999; 9:R235-R237 8. Canki-Klain N, Debevec M, Besli~ N, Aurias A, Mairal A. Molecular cytogenetic characterization of the CATCH 22 region disrupted by a de novo unbalanced transplantation. Ist European Cytogenetics Conference, Athens, Greece, June 22-25, 1997. Abstracts in Cytogenet Cell Genet 1997:77(1-2):104. 9. Cazeneuve C, Debevec M, Girodon E, Greguri} J, Ghanem N, Conteville P, Malbrel MP, Goossens M, Canki-Klain N. Paternal isodisomy X in a 47,XXX female in haemophilia B family. The European Society of Human Genetics. Book of Abstracts. Supplement to: Medizinische Genetik 1997; 9(2):65. 10. Stern MH, Soulier J, Rosenzwajg M, Nakahara K, Canki-Klain N, Auriaz A, Sigaux F, Kirsch JR. MTCP-1: a novel gene on the human chromosome Xq28 translocated to the T cell receptor alfa/omega locus in mature T cell proliferations. Oncogene 1993; 8:2475-83. 11. Stern MF, Zhang F, Auriaz A, Canki N, Griscelli C, Thomas G. Molecular characterization of the breakpoints in ataxia telangiectasia T-cell proliferations. In: Ninth International Workshop on Human Gene Mapping. Conference, Paris 1987. Cytogenet Cell Genet 1987;46/1:699. 12. Warburton D, Byrne J, Canki N. Chromosomal Anomalies and Prenatal Development. An Atlas. Osford Monographs on Medical Genetics No 21, New York:Oxford University Press, 1991. 13. Canki N, Tivadar I, @upan~i} N, Debevec M. Citogenetska {tudija sedmih bolnic z ataksijo-teleangiektazijo. Zdrav Vestn 1983 1983;52:567-70. 14. Canki N. U~inki genske koli~ine pri anomalijah X kromosoma. Zdrav Vestn 1981; 50:403-408. 15. Debevec M, Canki N. A pericentric inversion of chromosome 9 in a sterile woman and her mother: inv(9)(p23 q31). Clin Genet 1981;19:499. 16. Canki N, Konjajev Z, Debevec M, Rainer S, Rethore MO. Trisome 10q1 0qter par translocation familiale t(10; 14)(q24;q32). Ann Gnt 1980;23/3:176-178. 17. Canki N, Bou J. Zna~enje upotrebe kromosomskih tehnika pruga u antenatalnoj dijagnostici. Iugosl Ginekol Opstet 1980; 20:331-8. 18. Canki N, Debevec M, Re{ P. familial male sterility associated with rearrangementof chromosome structure transmitted by the mother:45,XX,-15-20,+t(15q20q),+t(20p2 1q), inv(9)(p11 q1209). In: European Society of Human Genetics. the Dubrovnik Symposium, Dubrovnik 1980. Clin Genet 1981;19:495. 19. Canki N, Dutrillaux B, Tivadar I. Dystrophie musculaire de Duchenne chez une petite fille porteuse dune translocation t(X;3)(p21;q13) de novo. Ann Gnt 1979;22:33-9. 20. Canki N, Dutrillaux B. Two cases of Familial Paracentric Inversion in Man Associated With Sex Chromosome Anomaly: 47,XXY,inv(5)(q21q32) and 45,,X,inv (7)(q11.3q22.3). Hum Genet 1979; 47:261-268. 21. Canki N, Debevec M, Rainer S. Pomen morfologije kromatid v klini~kicitogenetiki. Zdrav Vestn 1975;44:497-499. 22. Canki N, Rethor MO, Ferrand J, Lejeune J. Trisomija 9p zbog t(9p; 14q) te novo. Lije~ Vjesn 1975;97:103-5. 51 8It O a  #19Dd%ORZ 3;rwKNU_ag=ͶͶͶͶͶض5B*OJQJhnH B*CJOJQJhnH B* OJQJhnH B*OJQJhnH 5B*CJOJQJhnH 6B*OJQJhnH 5B*CJOJQJhnH 6B*CJOJQJhnH 5B*CJ OJQJhnH :+8IitEs$Rw 4_.[$1$+8IitEs$Rw 4_.[ 6 a  < d  * W ' M u  + [ y "KxAjDk )Pq-Tz d[ 6 a  < d  * W ' M u $1$  + [ y "KxAjDk )$1$)Pq-Tz%9Ox&X"Gr$1$%9Ox&X"Gr 8a#MvCj@i>m),P@pLru"Lw7Ns ( = f !.!V!!!!! dr 8a#MvCj@i$1$=Wjs8;FIjipbm,FPems$CKrtB*CJOJQJhnH B*OJQJhnH 5B*OJQJhnH X>m),P@pLru"$1$ bcgjt~     . 0 1 3 4 \ ^ ` f !1!4!{""####/#W#^###$$D$F$Z$]$`$k$r$u$x$z$$$$B*CJOJQJhnH 56B*OJQJhnH 5B*CJ OJQJhnH B*OJQJhnH 5B*OJQJhnH M"Lw7Ns ( = f !.!V!!!!!%"S"r"$1$!%"S"r""""#1#P#z####$A$`$x$$$$ %8%Z%%%%%&?&h&&&&&%'1'\'''''!(H(s(((()B)s))))*7*e****+,+W+}+++++++(,T,,,,,- -E-z----..5.Y.e...../3/_/l/////0 dr""""#1#P#z####$A$`$x$$$$ %8%Z%%%%%&?&h&&&$1$$$$$$$$$$$%%Z%\%e%l%%%%%%%%% &&?&F&a&h&&&&& '' '#'%'1'''''H([(m(s(y(((((())0)4)T)W))))**$*4*>*****b+g+p+z++++B*CJOJQJhnH 5B*CJ OJQJhnH B*CJOJQJhnH B*OJQJhnH 5B*OJQJhnH N&&&%'1'\'''''!(H(s(((()B)s))))*7*e****+,+$1$,+W+}+++++++(,T,,,,,- -E-z----..5.Y.e....$1$++,,..5.9.e.i...l/o/////00?0H000&1*1g1p111222222'3*3N3R33333334"45575;5p5t588::i<<=====Y>[>>>-?B*CJOJQJhnH 6B*OJQJhnH B*CJOJQJhnH B*CJ OJQJhnH 5B*OJQJhnH B*OJQJhnH 5B*CJOJQJhnH D../3/_/l/////0 0?0a000001&1I1g11111'2M2w22$1$0 0?0a000001&1I1g11111'2M2w222223'3N3w333333474b44445575`5p55556,6X6666707]77778818^8t88888 919^99999:D:q:::::";H;q;;;;<D<i<<<<==G=t===== d22223'3N3w333333474b44445575`5p55556,6X6$1$X6666707]77778818^8t88888 919^99999:D:q::$1$::::";H;q;;;;<D<i<<<<==G=t=====>I>Y>}>>>$1$=>I>Y>}>>>> ?-?[?????@+@Y@~@@@A!AIAvAAAAB'BZBzBBBB C6CWC~CCCC#DDDoDDDDDECEkEEEEF> ?-?[?????@+@Y@~@@@A!AIAvAAAAB'BZBzBBBB C$1$-?/???vAxAA'B)B7BHBLBZBDDmIIIJdLfL9M;MNNNN)OOP'PPQQQQRUUUV V#VV0W7WMWWWXX7X9X+YҺ5B*CJOJQJhnH 56B*OJQJhnH 5B*OJQJhnH 6B*CJOJ QJ hnH B*CJOJ QJ hnH B*CJOJQJhnH 6B*OJQJhnH 5B*CJOJQJhnH B*OJQJhnH B*CJOJQJhnH 5 C6CWC~CCCC#DDDoDDDDDECEkEEEEFrć%QrňB$1$̈́ׄ Ddކ>rć%QrňBd 8c 2iՋ1]+OxÍ=[ю%Pԏ)Ns c<^̒<Tfʓ /Q dBd 8c 2iՋ1]+OxÍ$1$Í=[ю%Pԏ)Ns c<^$1$s d_nΘܘpqtݤޤЦѦԦGHKެ߬014XY\efqYƺҕҕҕҕҕҕҕҕҕҕB*CJOJQJhnH 5B*CJOJQJhnH 5B*CJOJQJhnH 5B*OJQJhnH B*CJOJQJhnH B*CJOJ QJ hnH B*CJOJQJhnH 6B*CJOJ QJ hnH 6B*OJQJhnH B*OJQJhnH 5^̒<Tfʓ /Q̔<kDnƖ$1$̔<kDnƖ5e՗)WΘܘ2^{љ(OpšDk >]ۜ)Ox 1Zٞ2HnɟAnà:a.qt̢{ȣܣ6ܤ dƖ5e՗)WΘܘ2^{љ(OpšD$1$Dk >]ۜ)Ox 1Zٞ2Hnɟ$1$ɟAnà:a.qt̢{ȣܣ6ܤޤ$1$ܤޤ9ޥ"QtǦѦԦ,9ۧ0ި#KwBHKTUkŬ߬ :`׭HqϮ14>Y\fq =`ܱ?nϲ H{&IqGj d9ޥ"QtǦѦԦ,9ۧ0ި#KwB$1$BHKTUkŬ߬ :`׭HqϮ14$1$>Y\fq =`ܱ?nϲ H{$1$Y\B*OJQJhnH B*CJOJQJhnH B*CJOJQJhnH B*CJ OJQJhnH &IqGjDvö-\Ƿ߷ $1$jDvö-\Ƿ߷ 3Zo͸ LYֹ'DnxϺKlŻ=K|:gٽ > 3Zo͸ LYֹ'DnxϺKlŻ$1$=K|:gٽ$1$/ =!"#$% [$@$NormalmH <A@<Default Paragraph Font                    '8! )70i8o@'INWG_hpx9k@ &)"%+/. + ( ) + 1+ $.,(.=$+-?+YmqY[ )r"r"&,+.2X6:> CGLOQUZu^}bf(k|ossx|BÍ^ƖDɟB !0='MXlgvܤjDr Canki - KlajnF:\CITOGENETIKA.knjiga.doc@O@ `@``@``(@ G:Times New Roman5Symbol3& :ArialM  AFutura-BoldArial[ ATimes-NormalItalicArialA ATimesArialI  AHelveticaArialK  ATimes-BoldArialW ATimes-BoldItalicArialC AFuturaArial] AFutura-NormalItalicArial"1hF`H`|MB!0gk*Zna~enje citogenetike u klini~koj praksi iDr Canki - KlajnDr Canki - Klajn Oh+'0 $0 L X dpx+Zna~enje citogenetike u klini~koj praksi idna~Dr Canki - Klajntikr CNormaliDr Canki - Klajntik1 CMicrosoft Word 8.0k@G@@0| ՜.+,D՜.+,t0 hp  Medicinski fakultet u ZagrebukBMgj +Zna~enje citogenetike u klini~koj praksi i Title 6> _PID_GUIDAN{A43243E4-7C91-11D9-B964-0009411CCA4B}  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~     Root Entry F W1TableWordDocumentSummaryInformation(DocumentSummaryInformation8CompObjjObjectPool W W  FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.89q