ࡱ> 5@bjbj22 .XXr8t0<bxx"aaaaaaa$dR`f5a5aFbjXjXjX8ajXajXjXXZK[l iot JQ[`\b0b[,f"V2fK[fK[jX5a5aTXDETEKCIJA APOPTOZA Vilim }LENDER Institut za medicinska istra~ivanja i medicinu rada, Zagreb SA}ETAK Apoptoza ili programirana smrt stanice, ima vodeu ulogu u mnogim bioloakim procesima. Njezino odreivanje od velike je va~nosti u razli itim podru jima moderne biologije uklju ujui razli ite studije o embrionalnom razvoju, biologiji tumora te brojnih degenerativnih i imunodeficijentnih bolesti koje se povezuju s poremeajima u apoptozi. Mehanizam aktivacije i pokretanja apoptoti kog procesa vrlo je kompleksan i prate ga specifi ne morfoloake i biokemijske promijene stanica koje esto variraju ovisno o tipu stanica i specifi nim uvjetima okoline u kojoj rasu. Upravo iz tog razloga bitno je upotrijebiti viae razli itih detekcijskih metoda koje e obuhvatiti razli ite apoptoti ke stadije kako bi se izbjegli la~no pozitivni ili la~no negativni rezultati. Svaka od danas poznatih i koriatenih metoda ima svoje prednosti i nedostatke te niti za jednu od njih ne mo~emo rei da u potpunosti zadovoljava sve kriterije. U ovom radu prikazan je kratak pregled metoda koje se naj eae koriste pri detekciji apoptoza te osnovni morfoloaki i biokemijski procesi na kojima se te metode zasnivaju. Klju ne rije i: kaspaze, aneksin V, mikroskopija, proto na citometrija, elektroforeza UVOD Postoji veliki broj metoda za detekciju i kvantifikaciju apoptoza. Njihov odabir ovisiti e o tipu uzorka tj. modelu prou avanja utjecaja odreenih faktora na apoptozu stanice. Bitno je naglasiti da apoptozu treba detektirati dok su vidljive promijene prisutne (1). Naime, apoptoza pojedina nih stanica traje od 6-24 h, a kona ne produkte fagocitiraju susjedne stanice i makrofagi ne ostavljajui nikakve tragove smrti stanice. U nekim slu ajevima sr anih bolesti apoptoza miocita mo~e biti i du~a, bez fragmentacije jezgre ali uz intenzivno cijepanje i gubitak citoplazmatskih proteina (2). Unutar razli itih vrsta stanica nekog tkiva apoptoza se mo~e po eti razvijati u razli ito vrijeme nakon dodavanja nekog inicijatora, a du~ina pojedinih morfoloakih promjena mo~e varirati od stanice do stanice (3). Prou avanje i karakterizacija apoptoze ve dugi niz godina temelji se na razli itim in vitro i in vivo modelima, uklju ujui i biljne organizme (4, 5, 6). Detekcija nije uvijek jednostavna jer ponekad apoptozu ne prate karakteristi ne morfoloake promijene, ili pak fragmentacija DNA mo~e biti posljedica nekroze. In vivo detekcija apoptoze dodatno je ote~ana i ograni ena zbog primjene isklju ivo neinvazivnih metoda, a ote~avajua okolnost je i injenica da apoptozi svakoga trena podlije~e manje od 2 % stanica kao dio fizioloakog procesa u odr~avanju homeostaze tkiva, ato primjerice u slu aju zdrave jetre iznosi 1-5 apoptoti kih stanica na 10.000 hepatocita. Zato se najbolji rezultati u in vivo detekciji apoptoza postignuti kod akutnih procesa gdje je pojavnost apoptoti kih stanica privremeno visoka (odgovor tumora na kemoterapiju, akutne reakcije tkiva kod transplantacije itd), (7). DETEKTIRANJE MORFOLO`KIH PROMJENA PRI APOPTOZI Mikroskopija Morfoloake promijene koje prate po etnu fazu apoptoze i aktivaciju inicijatorskih kaspaza su gubitak mikrovila i stvaranje mjehuria na povraini stani ne membrane, te skvr enje stanice (8). Tipi an redoslijed morfoloakih promjena kod adherentnih stani nih linija uklju uje zaokru~ivanje stanica zbog gubitka veze s podlogom, ubrzano stvaranje i nestajanje mjehuria na povraini stanice, skvr enje stanice, polagana protruzija izdu~enih bi eva kod nekih stanica i kona no "grozdoliko" pupanje povrainske stani ne membrane i eventualna liza stanice nalik nekrozi, nekoliko sati nakon po etka apoptoze (3). Pokretanje ireverzibilnih apoptoti kih procesa (aktivacija efektornih kaspaza i endonukleaza) rezultira kondenzacijom kromatina u rasponu od to aka poja ane gustoe uz jezgrinu ovojnicu, do kona ne kru~ne ili srpolike distribucije kromatina uz promjenu volumena i oblika jezgre. U veini, ali ne i u svim tkivima, zavrano dolazi do fragmentacije stanice i formiranja malih apoptoti kih tjeleaaca. Neki autori smatraju da jedino promijene koje zahvaaju jezgru imaju dijagnosti ku vrijednost pri detekciji apoptoze (9), a te promijene se lakae mogu vizualizirati bojanjem fiksiranih stani nih kultura ili tkivnih rezova Giemsom, ili primjenom razli itih fluorescentnih DNK boja kao ato su propidium jodid (PI), hoechst i druge (10). Veina strukturnih promjena mo~e se detektirati pomou svjetlosnog mikroskopa, dok finije, osobito intranuklearne promijene, zahtijevaju koriatenje elektronske mikroskopije (11). U in vitro uvjetima prilikom detekcije apoptoze na kulturama stanica, esto se uvode dodatni testovi i boje (MTT test, Trypan blue), koje omoguavaju lakau diferencijaciju ~ivih stanica, u odnosu na one u kojima su po eli smrtonosni procesi (12). Neki aspekti funkcije i mehanizma apoptoze u biljnih stanica razlikuju se u odnosu na ~ivotinjske stanice. Tako primjerice u stanicama protoplasta dolazi do poveanja volumena centralne vakuole i kloroplasta, a time i do poveanja volumena protoplasta ato sugerira va~nu ulogu tih organela pri apoptozi biljnih stanica (4). Konfokalni laser pretra~ni mikroskop omoguava odreivanje patoloakih procesa na substani nom i stani nom nivou, kao i na nivou tkiva uz trodimenzionalni prikaz (13). Primjenom vitalnih boja koje ukazuju na fago-lizosomalnu aktivnost i acidifikaciju tkiva (Lyso Tracker Red, akridin oran~), te dodatnog fotomultiplikatora i softvera za obradu i kategorizaciju rezultata fluorescencije, mogue je praenje intenziteta apoptoze u pojedinim regijama embrija sisavaca tijekom embrionalnog razvoja (14). Laserskm pretra~nom mikroskopijom mogu se analizirati DNA "kometi" dobiveni komet tehnikom (15), kao i stanice ili embriji ozna eni aneksinom V (16). Fluorescentna mikroskopija takoer se u velikoj mjeri koristi pri detektiranju brojnih morfoloakih i biokemijskih apoptoti kih promjena koje se mogu vizualizirati specifi nim fluorokromima. Akridin oran~ je metakromatski fluorokrom koji razli ito oboji dvostruke lomove DNA (zelena fluorescencija), naspram jednostrukih lomova DNA (crvena fluorescencija). Na osnovu toga mogue je pratiti promijene u kondenzaciji i denaturaciji kromatina tijekom apoptoze, po evai od zelene fluorescencije kromatinske mase na periferiji jezgre u po etnoj fazi, do crvene fluorescencije fragmentirane jezgre i apoptoti kih tjeleaca u kasnoj fazi apoptoze (17). Primjena video-mikroskopije izuzetno je korisna za vizualizaciju redoslijeda morfoloakih apoptoti kih promjena pojedina nih stanica u stani nim kulturama (3). Proto na citometrija Citometrija je jednostavna, kvantitativna i visoko informativna metoda za odreivanje apoptoze na nivou pojedina nih stanica, pri emu je dovoljan relativno malen broj stanica u ispitivanom uzorku (18, 19). Razli ite morfoloake i biokemijske promjene apoptoze stanice mogu se koristiti za citometrijsko odreivanje, po evai od skvr enja stanice i posljedi ne promijene svjetlosnog signala citometra, preko aktivacije kaspaza (cistein aspartil proteaze), gubitka mitohondralnog membranskog potencijala, aktivacije endogenih endonukleaza koja rezultira redistribucijom fosfatidil serina, pa do kona nog gubitka integriteta stanice i formiranja apoptoti kih tijela (20). Prednost ove metode je mogunost kombiniranja rezultata dobivenih pomou prednjeg i bo nog svjetlosnog snopa (zbog promijene promjera apoptoti nih stanica i konformacije unutraanjih stani nih struktura), sa rezultatima analize stani nih markera tj. specifi nih fluorescentnih antitijela za pojedine apoptoti ke molekule kao ato su Fas, FasL, Bcl-2, p53, fosfatidil serin itd. (21-23). Virusna monoklonska antitijela ozna ena fluorokromom mogu se koristiti kako bi se razlu ila pojava apoptoze u virusom inficiranim stanicama ili susjednim neinficiranim stanicama (24). DETEKTIRANJE BIOKEMIJSKIH PROMJENA PRI APOPTOZI Zna ajnije biokemijske karakteristike apoptoze su sljedee: porast koncentracije Ca2+ iona, aktivacija endonukleaza i transglutaminaza, fragmentacija DNK, translokacija fosfatidilserina sa unutraanje na vanjsku stranu stani ne membrane, kaskadna aktivacija kaspaza, izlazak citokroma c i AIF (Apoptosis Inducing Factor) i druge (10). Aneksin V U po etnoj fazi apoptoze dolazi do premjeatanja fosfolipida fosfatidil serina sa unutraanje na vanjsku stranu stani ne membrane, ato omoguava fagocitima prepoznavanje apoptoti kih stanica i apoptoti kih tjeleaaca te njihovo uklanjanje bez izazivanja upalnog procesa. Aneksin V je protein iz skupine aneksina koji ozna en s fluorescentnim bojama specifi no ve~e fosfatidil serin, te se kao takav koristi za detektiranje apoptoze pomou proto ne citometrije (25-27) ili fluorescentne mikroskopije (28). Postoji i modificirana metoda analizatora slike (eng. image analysis) pri emu se koristi fluorescentni mikroskop povezan sa ra unalom preko video kamere, koja se uspjeano koristi za odreivanje apoptoze pomou aneksina V (29). Od boja za obilje~avanje najviae se koristi FITC (fluorescin izotiocijanat), ali i druge kao ato su GFP (zeleni fluorescentni protein) i izopropil--D-tiogalaktozid (30). Aneksin V je vrlo specifi na metoda osobito u po etnoj fazi apoptoze kada je o uvana cjelovitost stani ne membrane, jer nakon cijepanja i fragmentacije DNA postupno dolazi i do promijene propusnosti stani ne membrane. Jednako tako aneksin V e se vezati i na fosfatidil serin sa unutraanje strane stani ne membrane ukoliko je naruaena njena cjelovitost, kao primjerice u slu aju nekroze stanice. Kako bi mogli razlikovati nekroti ne, ~ive i apoptoti ke stanice, uvodi se dodatno bojanje s PI koji zbog velike molekularne mase ne prolazi kroz cjelovitu stani nu membranu. Ukoliko je stani na membrana oateena PI e ui u stanicu i obojiti stani nu jezgru zbog velikog afiniteta prema nukleinskim kiselinama (29). U kombinaciji PI boje s drugim DNK bojama niske molekularne mase (DAPI, Hoechst 33342/33258, Calcein-AM) koje prolaze stani nu membranu mogue je dodatno olakaati vizualizaciju apoptoti kih i nekroti nih stanica (31). Obzirom da se metoda mo~e primijeniti samo na ~ivim stanicama potreban je poseban standardiziran tretman stanica tijekom pripreme uzorka i bojanja (32). Ote~avajua okolnost u koriatenju aneksina V i interpretaciji rezultata je i injenica da eksternalizacija fosfatidil serina nije prisutna u svim stanicama tijekom apoptoze (svega oko 30%), i da se javlja relativno rano nakon segmentiranja stani ne jezgre (33). Fluorescin diacetat Premda se tipi na morfoloaka definicija apoptoze temelji na promjenama u jezgri, prethodne, rane promijene takoer se koriste za determinaciju. Skvr enje stanice je uobi ajena, rana karakteristika svih apoptoti kih modela. Laser skenirajua citometrija pojedina nih stanica je slo~ena metoda koja se bazira na viae parametara i viae razli itih laserskih snopova. Jedan od parametara je promjena intenziteta fluorescencije stanica obojanih fluorescin diacetatom, kao posljedica promijene stani ne hidroliti ke aktivnosti i smanjenja stani nog volumena u ranoj fazi apoptoze. Hidroliza ne fluorescentnog fluorescin diacetata u fluorescirajui fluorescin kao i nakupljanje fluorescina u stanici pokazatelj je stani ne enzimatske aktivnosti i o uvanja integriteta stani ne membrane. Kako je stani na aktivnost u po etnoj fazi apoptoze manja uslijed smanjenja stani nog volumena i skvr enja stanice, tako je i flurescecija slabija. Uz pomo kaspaznih inhibitora dokazano je da te promijene prethode aktivaciji kaspaza-3 i da nisu ovisne o njihovoj aktivaciji. Ova metoda omoguava praenje biofizi kih promjena pojedina nih stanica koje podlije~u apoptozi, kvantitativna je, i mo~e se koristiti pri odreivanju specifi ne rezistencije na apoptozu pojedina nih stanica ili subpopulacija nakon tretiranja razli itim spojevima (34). Aktivacija kaspaza Inicijatorske kaspaze 2, 8, 9 i 10 su enzimska skupina na vrhu kaspazne hijerarhije, koje cijepanjem aktiviraju drugu subpopulaciju kaspaza poznate pod nazivom efektorne kaspaze 3, 6 i 7. Ta aktivacija je regulirana lanovima bcl-2 porodice mitohondrijskih proteina i klju na je za nastavak ireverzibilnog progresa apoptoze. Kaspaze 3 razgrauju razli ite citoplazmatske i jezgrine proteine, te aktiviraju nukleze, ato posljedi no dovodi do cijepanja DNK na fragmente od 200 do 300 bp (baza-parova) (35). Determinacija aktivnosti kaspaza vrai se pomou razli itih metoda poput "immunoblotting" analize kaspaza ili razgraenog specifi nog kaspaznog supstrata, analize aktivnosti enzima cijepanjem umjetnih supstrata, kao i razli ite modifikacije tih tehnika uz upotrebu konfokalne i fluorescentne mikroskopije ili tekue citometrije. Ograni enje u seroloakoj detekciji kaspaza nastaju stoga ato antitijela prepoznaju prodomene, kako neaktivnih proenzimskih oblika, tako i aktiviranih kaspaza. Zbog toga je potrebno potvrditi rezultate odreivanjem kataliti ke aktivnosti kaspaza (36). Odreivanje enzimske aktivnosti bazira se na novim umjetnim bojama tj. supstratima. Jedan od supstrata za kaspaze 3 je PhiPhiLux, koji se mo~e primijeniti na ~ivim, intaktnim stanicama. Aktivirane kaspaze 3 cijepaju taj supstrata te nastaju fragmenti koji se akumuliraju u citoplazmi stanice i kao takovi teako prolaze kroz intaktnu stani nu membranu (9). Na tr~iatu su prisutni i razli iti kaspazni supstrati ozna eni fluorokromima, kao i gotovi testovi koji se baziraju na otpuatanju fluorokroma nakon cijepanja supstrata od strane kaspaza i flurometrijskom odreivanju intenziteta fluorescencije. Konjugat fluoroizotiocijanata (FITC) i ireverzibilnog inhibitora kaspaza Z-VAD-FMK (Promega) (eng. Carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-fluoromethylketone) koji prolazi kroz stani nu membranu, mo~e se koristiti za monitoring aktivnosti kaspaza in situ. U tom slu aju inhibicija aktivnosti kaspaza i porast unutarstani ne fluorescencije pokazatelj je ukupne aktivnosti kaspaza u stanici (37). Detekcija kaspaza koristi se kao biokemijski marker apoptoze, ali kako postoje podaci o aktivaciji kaspaza i u ne-apoptoti kim slu ajevima, potrebno je kombinirati morfoloake i biokemijske metode za njihovu potpunu i vjerodostojnu detekciju (36). Lamin B Aktivnost efektornih kaspaza koje cijepaju vitalne dijelove stanice, koristi se za detekciju apoptoze, pri emu najveu primjenu i pouzdanost ima lamin B-imunoreaktivnost. Lamin A, B i C su glavni strukturni proteini jezgrine ovojnice smjeateni na njenoj unutraanjoj strani. Njihova razgradnja tijekom apoptoze uzrokuje strukturne promijene jezgre i kona no gubitak njenog integriteta i fragmentaciju. Pomou antitijela za lamin B mogue je imunohistokemijski odrediti pozitivan signal, tj. prstenasto obojenje kod stanica koje nisu u apoptozi i negativan signal kod stanica koje su u kasnijoj fazi apoptoze (9$&(D~ ( | b "Fptbdfh"}xt}me]h9h}5h9hJl5 h3h3hU}o hU}o5h ]h1 h9h v+hh4/hiLh;h v+ h9hF h9h5 hF 5h9h ]5 h ]5 h15h ]5OJQJ\h ]5CJOJQJ\h^h^5CJaJh ]5CJaJh^h(/5CJaJ$&(Ddfh$&vvxz|$dh`a$gdZ $dha$gdZdhgdZgdZ $dha$gdZZ"$ :LN024:^|06lntv.04BDTź̨̤h9hOD6 h9hODh9h6 h9h h9h$_h9 h9hd=h$ h9h J h9hhhF h9hq h ] h9hF h9hT h9hlYhlY h9h4 h9hJlh9h~>V51TVV(*RTZfjlptvxz|ǿǻǴǴΞΞzu h"5 h9h3h3h8 h9hJl h9hF hF hF h9hW}*h9hk6 h9hk h9hhh$h9h$_6 h9h$_hF h9h h9hZ? h9hx: h9h *h ] h9hOD h9h=* !!,!>!B!F!l!n!p!t!v!0"n"## $$$$%&&''J(((((()())))))*ÿǴǴǡ~ww h9h,$c h9hr h9hF h9hhA h9hi h9h$ h9h0hS^hF h"h ] h9h7-h"h`H h9h>Sh$ h9hwhWB hWB6hWBhWB6hWBh=6 h15h"h"5.|l*-J0\5f:;;;EEEEEHHH(Z,ZTZdd$dh`a$gdZ $dha$gdWB $dha$gdZ $dha$gdZ*L*\*`*d*f*h*j*l*2+N+b+d+++++++,,x------..D/`/b/d////B0D0H0J0`0l0~0000ɻ}}v h9h,A h9hD] h9h h$ h9h- h9h7-hhS^ h9h]Ah9h|h6 h9h|h h9h"0 h9hTk h9hPh9hP6hWBh*86 h9hQL h9hih ] h9hhA h9h,$c-00T1111111l2n22222J3L3`3"4&4*4.40424:4@4B4r444R5V5Z568Z:^:b:d:f:;;;;;;;`=d=h=l====$?ǭhj? h9h1hWBh16hWBhWB6 h15 h9h| h9h h9h h9h hh h9hyl h9hD] h9hFh ]h h9h,A h9h6$?\?AACDDD DtExEEEEEFFF.HzH~HHHHHHDJJJ.L2L4L8L|LLM8MDNHNOOQTQRRSSSTT(U,U0U4UZVVĽıh|h sh$hhWBh6hWBhWB6 h9hhYh9hYH* h9hY h9hH<h9h15h9ho15h9h5 h9h"0hnAhj? h9h1 h9hL!6VVVVVVXXXXYZ"Z,ZTZ\\b@bdddddee e6e8eFehj? h9hr2 h9hd[ h9hd\j4uvvwww8xvxxx{R{{{48>@Bf ʝΝҝ֝ڝܝ~*j ~ԩةȬɽɽɱɭɽhh9h5hhhWBh6 h9hh1UhMhK h9h1hWBh16h9ho 5hj? h9h[/B). Imunocitokemijska metoda za detekciju lamina B pomou proto ne citometrije pokazala se kao manje pouzdana metoda u usporedbi s aneksinom V i TUNEL-om (32). Gel elektroforeza Jedna od naj eae koriatenih metoda za detekciju apoptoze temelji se na razdvajanju fragmenata DNK u gelu, pri emu se nakon bojanja etidij bromidom mogu uo iti fragmenti uniformnog razmaka tipa "ljestvica" (38, 33). Elektroforeza je zasigurno jedna od izbornih metoda u slu aju detekcije apoptoze na kulturama stanica ili u tkivima gdje dolazi do smrti stanica na viae-manje sinkroniziran na in (metamorfoza insekata i vodozemaca, embriogeneza), ali nije primjerena za veinu ostalih razvojnih sustava gdje proces stani ne smrti nije masovniji i sinkroniziran (16, 33). Komet test Gel elektroforeza pojedina nih stanica ili komet test jedna je od metoda koja se koristi za kvalitativnu i kvantitativnu procjenu genotoksi nosti. Pod utjecajem elektri nog polja nastali DNA fragmenti, ovisno o njihovoj veli ini, putuju prema anodi razli itom brzinom stvarajui rep nalik kometu. Prema podacima o du~ini repa i postotku DNA u repu izra unava se "repni moment", na osnovu kojega se mogu razlikovati apoptoti ke od nekroti nih stanica (15). Apoptoza stanice u svojoj po etnoj fazi mo~e dati tipi nu sliku kometa koja bi se pogreano mogla okarakterizirati kao genotoksi na, a ne apoptoti ka (39, 40). Jednako tako, ova metoda zbog brzine apoptoti kog procesa i osjetljivosti prema malom broju lomova DNA, nije pogodna za kvantitativno odreivanje apoptoze (41). TUNEL (eng. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) TUNEL je jedna od eae koriatenih metoda za detekciju i kvantifikaciju apoptoza. Postoji viae metoda za detekciju apoptoze koje se temelje na ozna avanju slobodnih 3'OH krajeva DNA fragmenata pomou modificiranih nukleotida (biotin-dUTP, digoksigenin-dUTP, fluorescin-dUTP), u reakciji kataliziranoj egzogenim enzima, i to terminalnom deoksinukleotidil transferaza (TdT) za dvostruke lomove DNA i DNA polimerazom za jednostruke lomove. TUNEL podrazumijeva obilje~avanje 3'OH krajeva pomou nukleotida ozna enog fluorescin izotiocijanatom (fluorescin-dUTP). Uzorci se mogu analizirati pomou proto ne citometrije (20, 42, 43) ili svjetlosne, fluorescentne (21) i elektronske mikroskopije (44). Enzimski markeri, peroksidaza (POD) i alkalna fosfataza (AP), koriste se u dva modificirana TUNEL testa prilikom detekcije apoptoze pojedina nih stanica svjetlosnim mikroskopom (45). Obzirom da je postupak ozna avanja kompleksan i uklju uje mnogo reagensa mogui su la~no negativni rezultati pa je stoga neophodno uklju iti pozitivnu i negativnu kontrolu (20). Metoda obilje~avanja 3'OH krajeva fragmenata DNA ima viaestruke prednosti pri analizi klini kog materijala (biopsati tumora), kako bi se dobio uvid o indukciji apoptoze nakon primijenjene anti-tumorske terapije (46). Iako je TUNEL jedna od najspecifi nijih metoda za detekciju apoptoze postoji mogunost la~no pozitivnog ozna avanja lomova DNK stanica koje nisu u apoptozi (nekroti ne stanice, Okazaki fragmenti u S-fazi stani nog ciklusa), meutim njihov broj je znatno manji od broja fragmenata apoptoti kih stanica (16, 32, 29, 47). ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Citoplazmatski DNK fragmenti (mono- i oligonukleosomalni) mogu se takoer detektirati pomou imunoenzimnog testa ELISA, koristei monoklonska protutijela za DNK i histone (48, 49). Promjena mitohondrijskog transmembranskog potencijala Tijekom apoptoze dolazi do promjene propusnosti vanjske membrane mitohondrija koja postaje propusna za proteine, a na unutraanjoj strani mitohondrijske membrane smanjuje se transmembranski potencijal "m. Posljedi no, topivi intermembranski proteini poput citokroma c i AIF (Apoptosis-Inducing Factor) otpuataju se u citoplazmu stanice i pokreu daljnju aktivaciju kaspaza. Promijene u membranskom potencijalu kao i translokacija proteina mo~e se koristiti za detekciju tih ranih apoptoti kih dogaaja na osnovi fluorokromskog ozna avanja i njihovog odreivanja citofluorimetrijski ili fluorescentnim mikroskopom (50). Spektroskopija Infracrvena spektroskopija razvija se dugi niz godina kao laboratorijska i klini ka metoda za ranu detekciju apoptoze tumorskih stanica, nakon primijenjene anti-tumorske terapije u in vivo uvjetima. Postoji direktna povezanost izmeu pojave apoptoze i promjena u spektru infracrvenog zra enja zbog strukturnih promjena stani nih proteina i DNA koje prate apoptozu (1, 51). Jednako tako metaboli ke promijene koje prate apoptozu mogu se pratiti pomou razli itih markera (P, H, C) na osnovi fenomena magnetske rezonancije. U tu svrhu za analizu se koristi spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije (52, 7). LITERATURA 1. Liu KZ, Mantsch HH. Apoptosis-induced structural changes in leukemia cells identified by IR spectroscopy. J mol structure 2001;265-566:299-304. 2. Communal C, Sumandea M, Tombe P, Narula J, Solaro RJ, Hajjar RJ. Functional consequences of caspase activation in cardiac myocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:6252-6. 3. Collins JC, Schandl CA, Young KK, Vasely J, Willingham MC. Major DNA fragmentation is a late event in apoptosis. J Histochem Cytochem 1997;45(7):923-34. 4. Watanable M, Setoguchi D, Uehara K, Ohtusaka W, Watanabe Y. Apoptosis-like cell death of Brassica napus leaf protoplast. New Phytol 2002;156:417-26. 5. Sun Y, Zhou J, Dai Y, Zhai Z. Menadione-induced apoptosis and its mechanism in plants. Chin Sci Bulletin 2000;45:350-4. 6. Hao-Ming C, Jun Z, Yao-Ren D. Cleavage of lamin-like protein in in vivo and in vitro apoptosis of tobacco protoplasts iduced by heat shock. FEBS Lett 2000;480:165-8. 7. Brauer M. In vivo monitoring of apoptosis. Prog Neuropsyhopharmacol Biol Psychiatry 2003;27:323-31. 8. Corcoran BG, Fix L, Jones DP, Moslen MT, Nicotera P, Oberhammer FA, Buttyan R. Apoptosis: molecular control point in toxicity. Toxicol Appl Pharmacol 1994;128:169-81. 9. Huppertz B, Frank HG, Kaufmann P. The apoptosis cascade  morphological and immunohistochemical methods for its visualization. Anat Embryol 1999;200:1-18. 10. Kosmider B, Osiecka R, Ciesielska E, Szmigiero L, Zyner E, Ochocki J. Induction of apoptosis and necrosis in lymphocytes by the cis-Pt(II) comlex of 3-aminoflavone in comparison with cis-DDP. Mutat Res 2004;558:169-79. 11. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26:239-57. 12. Minervini F, Fornelli F, Flynn KM. Toxicity and apoptosis induced by the mycotoxins nivalenon, deoxinivalenol and fumonisins B1 in a human erythroleukemia cell line. Toxicol In Vitro 2004;18:21-8. 13. Smith GJ, Bagnell CR, Bakewell WE, Black KA, Bouldin TW, Earnhardt TS, Hook GE, Pryzwansky KB. Application of confocal scanning laser microscopy in experimental pathology. J Electron Microsc Technol 1991;18:38-49. 14. Zucker RM, Hunter ES, Rogers JM. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods 1999;18:473-80. 15. Fairbairn DW, Walburger DK, Fairbairn JJ, O'Neill KL. Key morphologic changes and DNA strand breaks in human lymphoid cells: discriminating apoptosis from necrosis. Scanning 1996;18:407-16. 16. Zakeri Z, Lockshin RA. Cell death during development. J Immunol Methods 2002;265:3-20. 17. Dobrucki J, Darzynkiewicz Z. Chromatin condesation and sensitivity of DNA in situ to denaturation during cell cycle and apoptosis - a confocal microscopy study. Micron 2001;32:645-52. 8. Warrington RC, Norum JN, Hilchey JL, Watt C, Fang WD. A simple, informative, and quantitative flow cytometric method for assessing apoptosis in cultured cells. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2003;27:231-43. 19. Jayaraman S. Intracellular determination of activated caspases (IDAC) by flow cytometry using a pancaspase inhibitor labeled with FITC. Cytometry 2003;56A:104-12. 20. Vermes I, Haanen C, Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods 2000;243:167-90. 21. Snchez-Torres LE, Vargas FD. Apoptosis: the phenomenon and its determination. Tc Pecu Mx 2003;41:49-62. 22. Lund PK, Westvik B, Jo GB, vsteb JR, Haug KBF, Kierulf P. Flow cytometric evaluation of apoptosis, necrosis and recovery when culturing monocytes. J Immunol Methods 2001;252:45-55. 23. Mirakian R, Nye K, Palazzo FF, Goode AW, Hammond LJ. Methods for detecting apoptosis in thyroid diseases. J Immunol Methods 2002;265:161-75. 24. McSharry JJ. Analysis of virus-infected cells by flow cytometry. Methods 2000;21:249-57. 25. Roser S, Pool-Zobel BL, Rechkemmer G. Contribution of apoptosis to responses in the comet assay. Mutat Res 2001;497:169-75. 26. Mller G, Rosner H, Rohrmann B, Erler W, Geschwend G, Grfe U, i sur. Effects of the mycotoxin ochratoxin A and some of its metabolites on the human cell line THP-1. Toxicology 2003;184:69-82. 27. Vamvakopoulos JE, Green C. HGM-CoA reductase inhibition aborts functional differentiation and triggers apoptosis in cultured primary human monocytes: a potential mechanism of statin-mediated vasculoprotection. BMC Cardiovascular Disorders 2003;3/6:1471-2261. 28. Shounan Y, Feng X, O'Connell PJ. Apoptosis detection by annexin V binding: a novel method for the quantitation of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods 1998;217:61-70. 29. Plsier B, Lloyd DR, Paul GC, Thomas CR, Al-Rubeai M. Automatic image analysis for quantification of apoptosis in animal cell culture by annexin-V affinity assay. J Immunol Methods 1999;229:81-95. 30. Ernst JD, Yang L, Rosales JL, Broaddus VC. Preparation and characterization of an endogeously fluorescent annexin for detection of apoptotic cells. Anal Biochem 1998;260:18-23. 31. Gatti R, Belletti S, Orlandini G, Bussolati O, Dall'Asta V, Gazzola GC. Comparison of annexinV and Calcein-AM as early vital markers of apoptosis in adherent cells by confocal laser microscopy. J Histochem Cytochem 1998;46(8):895-900. 32. Kylarov D, Prochzkov J, Mad'arov J, Bartoa J, Lichnovsk V. Comparison of the TUNEL, lamin B and annexin V methods for the detection of apoptosis by flow cytometry. Acta Histochem 2002;104(4):367-70. 33. Willingham MC. Cytochemical methods for the detection of apoptosis. J Histochem Cytochem 1999;47(9):1101-9. 34. Zurgil N, Sunray M, Shafran Y, Afrimzon E, Deutch M. A novel approach for on line monitoring of apoptotic cell shrinkage in individual live lymphocytes. J Immunol Methods 2003;281:37-49. 35. Basc Z, Everson BR, Eliason FJ. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res 2000;60:4623-8. 36. Khler C, Orrenius S, Zhivotovsky B. Evaluation of caspase activity in apoptotic cells. J Immunol Methods 2002;265:97-110. 37. Voronina E, Wessel GM. Apoptosis in sea urchin oocytes, eggs, and early embryos. Mol Reprod Dev 2001;60:553-61. 38. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata SA. Caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 1998;391:43-50. 39. Phoucroun P, Gillet D, Dorange G, Sawicki B, Dewitte JD. Comet assay and early apoptosis. Mur Res 2001;478:89-96. 40. Roser S, Pool-Zobel BL, Rechkemmer G. Contribution of apoptosis to responses in the comet assay. Mut Res 2001;497:169-75. 41. Olive PL, Frazer G, Banth JP. Radiation-induced apoptosis measured in TK6 human B lymphoblast cells using the comet assay. Radiat Res 1993;136:130-6. 42. Ehemann V, Sykora J, Vera-Delgado J, Lange A, Otto HF. Flow cytometric detection of spontaneous apoptosis in human breast cancer using the TUNEL-technique. Cancer Lett 2003;194:125-31. 43. Bromidge TJ, Howe DJ, Johnson SA, Phillips MJ. Adaptation of the TdT assay for semi-quantitative flow cytometric detection of DNA strand breaks. Cytometry 1995;20:257-60. 44. Colitti M, Musetti R, Stefanon B. Detection of apoptosis-inducing factor in involuting mammary tissue by immunoelectron microscopy. Micron 2004;35:307-10. 45. Dubsk L, Metalov E, Maek I. Detection of apoptosis in paraffin embadded tissues: the influence of tissue type and fixation. Acta Vet Brno 2002;71:529-33. 46. Gorczyca W, Gong J, Darzynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res 1993;53:1945-51. 47. Handzel MJ, Nishioka WA, Raymond Y, Allis CD, Bazett-Jones DP, Th'ng JPH. Chromatin condensation is not associated with apoptosis. J Biol Chem 1998;273:24470-8. 48. Kim JH, Park DC, Kim JW, Choi YK, Lew YO, Kim DH, i sur. Anitumor effect of GnRH agonists in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 1999;74:170-80. 49. Bidinger B, Torres R, Rossetti RG, Brown L, Beltre R, Burstein S, i sur. Ajulemic acid, a nonpsychoactive cannabinoid acid, induces apoptosis in human T lymphocytes. Clin Immunol 2003;108:95-102. 50. Castedo M, Ferri K, Roumier T, Mtivier D, Zamzami N, Kroemer G. Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis. J Immunol Methods 2002;265:39-47. 51. Brindle KM. Detection of apoptosis in tumors using magnetic resonance imaging and spectroscopy. Advan Enzyme Regul 2002;42:101-12. 52. Hakumki JM, Brindle KM. Techniques: Visualizing apoptosis using nuclear magnetic resonance. Thrends Pharmacol Sci 2003;24:146-9. SUMMARY APOPTOSIS DETECTION Apoptosis or programmed cell death is the most important process in huge number of biological processes. Its detection is very important for different fields of modern biology including embryonic development, tumor biology and numerous degenerative and immunodeficient syndromes associated with apoptotic disorders. The mechanism of apoptosis activation is very complex and accompanied with specific morphological and biochemical cell changes which differ depending on cell type and cell growing area conditions. For that reason it is essential to use several methods which detect different steps of apoptosis thus avoiding false positive or false negative results. All known and used methods have some advantages and disadvantages but none of them completely satisfy desired conditions. In this short review most used methods for apoptosis detection are presented, together with biological and biochemical processes on witch those methods are based. Key words: caspases, annexin V, microscopy, flow cytometry, electrophoresis PAGE  PAGE 13 Ȭ  *t̲вԲز޲L6"$&D "&*p  2˽Ǧh9h5h9hU-5 hWB5 h75f5ho h9ho 6 h9ho hWBho 6h9ho 5h9h15\hM h9h1hWBh16h9h15 hhhWBh6 h9hhj?ho2D46\$l:R"\ $dha$gdWB $dha$gdZ $dha$gdWB2468.0Z^"&jn8<Zdhx@FPRV "&Z` &BH h9h>+h>+hfhMh.h9hn 6 h@,hn h9hn hn h9hn 5 h|5L"DzZ$D\F $dha$gdZ4z^"$DH"BDFZ\`FJTVjlTX;͵ͱ h9h h h9h$PJh9h$5 h$h$ h9h$h$ h9h{h{ h>+h>+ h@,h>+hM h9h>+h>+@T@BDFHJLN $dha$gdZ $dha$gdZ>@BDXZ\hjlpr~»~s~he0JmHnHuhe he0Jjhe0JU hShShSh5 h9h8h9h ]5h ] h ]5\ h9hHThf@hHTmH sH hf@hf@mH sH  h9hKV heh0V he5 h0V5 hf@5hn h9hn NPRTVXZlnp &`#$gd) $dha$gdZ,1h. A!"#$% @@@ NormalCJ_HaJmHsHtHZ@Z ] Heading 1$$5$7$8$9D@&H$a$5OJQJaJDA@D Default Paragraph FontRiR  Table Normal4 l4a (k(No List4 @4 )Footer  p#.)@. ) Page Number6U@6 m Hyperlink >*B*phH"H F Balloon TextCJOJQJ^JaJV>@2V ]Title$dh5$7$8$9DH$a$5CJOJQJaJ4r"^_`aij   d; 6%3B C M ))*)Y.Z.m.f0156777:::<<<??E@|FF[G\GGIIJxLyLzL{LLLMMfNNyO"PP3QQRLSTT}U?VVVW3XXQYY}Z[k[[\]l^5__`abb[ccNddteefLggh;ijjNkllImmmmmmmmmmmmmqqq r rrrrrrrrrrrrr"r#r$r0r1r2r5r00p0p00!0!0!p0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!p0!00!000!0!0!0!0!0!000!p0!p00!p0!0!p0000!p0(0(0!p0(0(0!p0!00!00!00!p0000!808080!p08080!p0800p0@0!p0@0@0!00H0!H0H0H00!p0H0!H0!000!H0!H0P0!0!P0!P0!00!P0!P0!P0!P0!P0!P0!0!0!X0!X0!0!X0!0!0!X0!X0!X0!X0!`0!`0!0!0!0!0!00`0`0`0`0`0h000h0h0h0h0h0p00h0p000p0h0p00p0p0p0p0p0p0p0p0p00p0p0p0p0p0p0p0@0@0My00@0@0My000@$ "T*0$?V(luȬ2>ABCEFGHJK|dDN?DI@ !!jrZb LT$,frETYa t v w {   e o  < H ) 1 ? M N U b k KSs *2RZ &`fgk hs%/6?v&*+28?@ETf !+ ,]jlsty}NZmu #+@H 1:ox!+,2lx #//;jr"[gjz   " # + , 2 C J ] e } ! !!Y!`!y!!!!!!!! ""t"w"y"~"""####Y#c#d#q#######$$$$$$$$%%~&&&&&&L'X'0(8(y(((((() )!)))R)Z))*******+&+^+f+++++++++++`,h,,,,,,,,,-----..*.e.l.m.z.{........ ////O/R/^/m/////////0 0O0Q000000000n1x11111112 22)2E2L2222233!3*3o3v31494M4Z44444445 5 5585B5C5J5V5]5`5c5e5q5r5w5x5~55555555555!6(626@6q6x666666667777777$848c8k888C9U999999:.:9:n:w:::::$;*;+;3;x;;;;O<[<<<i=x=S>X>>>>>&?2?9?D?t??????@@@#@$@,@-@1@2@6@7@:@;@C@@@@@A%A'A-A.A2A4A@AAAEAGAQARAVArA{AAAAAAAAA0B:BEBOBPB_BaBkBlBpBBB CC)C2CvC~CDDE E E$EyEEEEEEUFaFFFFFFFFFFFFFGG(G3GIGPGeGtGuGGGGGGH)H?HNHZH]HsHHHHHHHHHHII3I@IsIIIIIII JJ(J|JJJJJJJJKKrKzKKK?LMLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLMM%M)M1M5M:M>MDMHMNMSMYM^MhMiMuMvMxMyMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMNNN N"N*N/N0N2N3NO?OBOCOLOMOOOPOVOXO\O]O`OaOiO|OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOPPP PP%P+P/P1P2P6P7PAPBPDPEPNPPPTPUPhPiPmPnPxPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPQQ Q QQQQQ!Q6Q>QBQGQLQTQXQ[Q\QeQfQmQpQ}Q~QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQRR RRRR$R%R'R(R1R2R5R6R>R?RARBRMRNRPRQRTRURXRYR[R`RfRgRiRlRxRyR{R|RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRSSSSSSSSSS%S&S.S0S2S5S;S]SeSiSnSsS{S|SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSTTTTT#T*T/T7TU@UAUIUPUXUYUcUeUlUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU V VVVVV$V&V.VCVIVMVUVZV^V_VdVeVkVlVwV{VVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVWWW W WWWWWW$W,W-W7W8W=W?WEWYWcWhWmWrWyW~WWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWXXXX"X7X@XDXQXRX_X`XbXcXlXmXuX}XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXYY Y YYYYY!Y"Y&Y'Y,Y0Y7Y8Y?YUY\Y]YcYhYnYsY|Y~YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYZZZZZZZZ Z)Z+Z3Z4Z7Z8Z@ZAZEZFZOZPZYZ]ZdZeZlZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ[[['[([*[1[9[:[?[@[B[C[G[H[Q[S[Z[o[t[x[|[}[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[\ \\\\!\%\*\5\<\=\?\@\C\D\M\N\X\[\^\d\f\g\j\k\v\z\}\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ ]]]]]]$]%]'](]0]1]8]?]H]L]U]V]_]`]b]c]i]j]r]s]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]^^ ^^^^^^^^)^*^,^-^1^2^:^;^G^K^R^S^Z^p^w^{^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^__ _ _____$_9_>_C_G_K_R_W___d_o_p_s_t____________________________` ````&`*`1`6`@`A`C`D`L`M`P`Q`X`\`^`_`d`e`j`k`r`s`u`v```````````````````````aa aaaa'a(a*a+a.a>aAaBaIaLaSaTaWaXa[a\aeafahaiarasauavaza{aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaabb#b'b-b1b8bc@cFcGcJc_cecicqcucccccccccccccccccccccccccccdddd d dddddd d%d&d-d3d9d:d=dRdWd[dcdgdodsdxd|dddddddddddddddddddddddde eeee e$e+e/e6e;e@eAeFeGeJeKePeQeZe\e_e`ecexe}eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee ffff f'f(f1f2f:f;f=fJfUfVf[f\fafbfefffkflfqfsfyfzf}fffffffffffffffffffffffffffg g gggggg#g,g.g4g5g9gPgXg]gagfgmgrgzggggggggggggggggggggggggggggggggh hhhh!h*h+h-h.h7h8h@hAhGhHhJhKhUhVh]h^hdhehghhhvhwhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhiii i iiiiii"i%i?iGiSi`idiminipiui{i|iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiijjj'j,j3j7jV?VVVUWVW2X3XXXPYQYYY|Z}Z [[j[k[[[\\]]k^l^4_5___``aabbbbZc[cccMdNdddseteeeffKgLggghh:i;ijjjjMkNkllllHmImmmmmmq rr2r5r"   ??{LLL^MMM>NeNNNXOyO0SKSxTTeU|U&V>V?VZVW2XQYsYYYZ [[[S[j[``aaabbb@cZccc/dMdNddd;eefsffggjj0kMkklll&mHmImfmmmmmmmmr2r5rr2r5rKorisnik;=^`o(. ^`hH. pLp^p`LhH. @ @ ^@ `hH. ^`hH. L^`LhH. ^`hH. ^`hH. PLP^P`LhH.;=dclS5!t|a / Ndr(0Pe[b~n ZA=0Vm s-//`HOl7 +9`=KVC-8 m!L!"-"X"b"d"M#&'C'fS'z(:)/*n*W}*>+ v+@,7-.Z-.(/4/Uw0c1n1o1(2?2r233=4p5(7a7x7*8$X8j9{9wL:x:H<$=>>#>Q>Z>j?Z?A,A]AnAWB(CZ%C*KDODiDEuEEhF/H"@HK0KnjKiLdM6MP NKN|O4O}QHT~>VBVoVlYd[2\D]O]^]S^$_i#`TVaVa,$c75f*Vg\h|h_iEliY0jd\jJlhlylnU}o{,p2p q8s!sx_sDttu3vw69xFz,.{R{||*,|+}X} t}A~8#v\ Q=Tk `? *)A")k0L,e1pDLFS;DQL\\a,K _} BfAJUm+"0Quum=2 Jn >Sv_hLW ib )f@T@BauMoIP2S`u a(.Xi,$f OX=U-8z ;|Rfo Q9<==[/Y8bylR#cpB2 $hA^ruSkBIF |y#)r)V44q FN5ed=QN_ fXW ]1{.T,6FxNouq'^">h(Q,s;DXkb~w8>H}?AMZ$8$"{L5r1@mm mm   (-/1245894r`` `````$`*`0`2`4`D`H`X`b`f`j`l`p`r`x`UnknownG: Times New Roman5Symbol3& : Arial;|i0BatangY Arrus L2Times New Roman5& zaTahoma"1|Fd뜆ڜF a:a:!r4dqq 3QH)?(7RANE APOPTOTI KE PROMIJENE KorisnikKorisnik Oh+'0 $0 L X d p|RANE APOPTOTIKE PROMIJENE ANE KorisnikTOToriori Normal.dotT KorisniktT247Microsoft Word 10.0@!@S @4@Vlt a՜.+,0 hp|  IMI:qA RANE APOPTOTIKE PROMIJENE Title  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~Root Entry Fot Data 1TablefWordDocument.SummaryInformation(DocumentSummaryInformation8CompObjj  FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.89q