Naslov
Studij reakcija kataliziranih oksidazama aminokiselina
(Study of the reactions catalyzed by amino acid oxidases)

Autori
Findrik, Zvjezdana

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, doktorska disertacija

Fakultet
Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije

Mjesto
Zagreb

Datum
19.10

Godina
2006

Stranica
120

Mentor
Vasić-Rački Đurđa

Ključne riječi
oksidaza aminokiselina; dehidrogenaza aminokiselina; regeneracija koenzima; kinetika enzimske reakcije
(amino acid oxidase; amino acid dehydrogenase; coenzyme regeneration; enzyme kinetics)

Sažetak
Važnost čistih aminokiselina odnosno optički čistih spojeva u današnjoj farmaceutskoj industriji je neupitna. Osim što se takvi spojevi koriste kao prekursori u proizvodnji lijekova i drugih važnih kemikalija, koriste se i u drugim granama industrijske proizvodnje (agrokemikalija, infuzijske otopine i dr.). Stoga je u ovom radu proučavana enzimska sinteza čistih oblika aminokiselina iz pripadajućih racemata katalizirana oksidoreduktazama. Korištene su četiri oksidaze aminokiselina i jedna dehidrogenaza aminokiselina. Dvije oksidaze L-aminokiselina su životinjskog porijekla (kraljevska kobra roda Crotalus adamanteus i Crotalus atrox), a dvije oksidaze su bakterijskog porijekla: oksidaza L-aminokiselina iz Rhodococcus opacus i oksidaza D-aminokiselina iz Arthrobacter protophormiae. L-fenilalanin dehidrogenaza također je bakterijskog porijekla (Rhodococcus sp. M4). Potpunom oksidacijom L-aminokiseline u racematu aminokiselina moguće je proizvesti čistu D-aminokiselinu u smjesi s pripadajućom  -keto kiselinom. Ta se dva kemijska spoja razlikuju po svojim karakteristikama, te ih je moguće jednostavno razdvojiti. Analognim se postupkom katalitičkim djelovanjem oksidaza D-aminokiselina može sintetizirati čista L-aminokiselina. Eksperimenti oksidacije aminokiselina su provedeni u šaržnom reaktoru sa i bez katalaze te u protočno kotlastom enzimskom membranskom reaktoru. Kao supstrati su korištene dvije aminokiseline: metionin i 3, 4-dihidroksifenilalanin (DOPA). U svim je šaržnim eksperimentima postignuta 100 %-tna konverzija odgovarajućeg izomera aminokiseline. To nije bio slučaj za eksperimente provedene u protočno kotlastom enzimskom membranskom reaktoru, gdje je došlo do deaktivacije enzima. Osim oksidacijom racemata kataliziranom oksidazama aminokiselina ispitana je i mogućnost sinteze D-aminokiselina katalitičkim djelovanjem L-fenilalanin dehidrogenaze iz Rhodococcus sp. Razlika u djelovanju oksidaza i dehidrogenaza aminokiselina je u ovisnosti dehidrogenaze o vanjskom dodatku koenzima. Naime, poznato je da oksidaze aminokiselina imaju u svojoj strukturi čvrsto vezan koenzim flavin adenin dinukleotid (FAD), dok su dehidrogenaze ovisne o prisustvu koenzima nikotinamida adenina dinukleotida (NAD(P)+ / NAD(P)H) koji nije vezan u strukturi enzima. Eksperimenti oksidacije L-metionina katalizirani L-fenilalanin dehidrogenazom su provedeni u šaržnom reaktoru, a kao supstrat je korišten samo L-metionin jer enzim nije pokazao aktivnost na L-DOPU kao supstrat. Za sve je korištene enzime ispitana reakcijska kinetika metodom početnih brzina. Iz eksperimentalnih mjerenja procijenjeni su kinetički parametri. Korištene su metode nelinearne regresije: simpleks metoda i metoda najmanjih kvadrata koje se nalaze u programskom paketu SCIENTIST. Razvijeni su matematički modeli za pojedine reakcijske sustave i za različite tipove reaktora. Obzirom da je konverzija L-metionina u sustavu njegove oksidacije kataliziranom L-fenilalanin dehidrogenazom bez regeneracije koenzima bila 5 %, ispitane su tri metode regeneracije koenzima: katalizirane NADH oksidazom iz Lactobacillus brevis i L-laktat dehidrogenazom iz zečjeg mišića, te uz dodatak fenilpiruvata u sustav. Prva od navedenih metoda je bila najuspješnija, te je postignuta konverzija L-metionina od 100 %. U sustavu regeneracije koenzima kataliziranog L-laktat dehidrogenazom je pri navedenim uvjetima postignuta konverzija L-metionina od oko 81 %, dok metoda regeneracije koenzima dodatkom fenilpiruvata nije pogodna zbog inhibicije fenilpiruvatom u reakciji oksidacije L-metionina. U ovom je sustavu postignuta konverzija L-metionina od 20 %. Ispitan je i kompleksan sustav dobivanja optički čiste aminokiseline koji se sastojao od prevođenja D-metionina u L-metionin uz četiri prisutna enzima. Uz prisustvo oksidaze D-aminokiselina D-metionin je oksidiran u keto kiselinu. Keto kiselina je reducirana uz L-fenilalanin dehidrogenazu u L-metionin u sustavu s regeneracijom koenzima kataliziranim formijat dehidrogenazom. Vodikov peroksid nastao u prvoj reakciji je bio uklonjen dodatkom katalaze. Postignuta je potpuna konverzija D-metionina u L-metionin u ekperimentima provedenim u šaržnom reaktoru.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biotehnologija

POVEZANOST RADA