Naslov
Karakterizacija rekombinantnih proteina tehnikama tekućinske kromatografije i spektrometrije mas
(Characterisation of recombinant proteins by liquid chromatography and mass spectrometry techniques)

Autori
Cindrić, Mario

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, doktorska disertacija

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
13.07

Godina
2004

Stranica
130+XVIII

Mentor
Drevenkar, Vlasta

Ključne riječi
Karakterizacija rHuINF a-2b / spektrometrija masa / kromatografija / triptički fragmenti / Lys-C / Glu-C / 2-D gel-elektroforeza / poslijeionizacijska fragmentacija / MS/MS / izmjena H/D
(rHuINF a-2b characterization / mass spectrometry / chromatography / tryptic fragments / Lys-C/ Glu-C/ 2D gel-electrophoresis / post-source decay / MS/MS / H/D exchange)

Sažetak
Makromolekula rHuINF a-2b visoke čistoće (98 %) i strukturne očuvanosti proučavana je tehnikama spektrometrije masa (MALDI-TOF i Q-TOF), tekućinske kromatografije (LC-UV-DAD-FLD, LC-MS i LC-MS/MS) i spektroskopije (CD) kao predložak analiza potrebnih za pravilnu karakterizaciju rekombinantnih proteina. Analizama intaktne makromolekule nađen je udio a-uzvojnice od 56 %. Snimljeni su ekscitacijski i emisijski spektri fluorescencije te UV spektri rHuINF a-2b analiziranog gel-filtracijskom kromatografijom. U dva neovisna mjerenja spektrometrima masa Q-TOF i MALDI-TOF određen je m/z intaktne makromolekule 19 265 ± ; 1. Kromatografijom obrnutih faza s Q-TOF- om kao detektorom i tehnikom MALDI-TOF analizirani su triptički fragmenti rHuINF a-2b, čime je identificirano 95 % primarne strukture proteina. Potpuna identifikacija slijeda aminokiselina postignuta je analizama fragmenata nastalih cijepanjem proteinazama Lys-C i Glu-C. Triptičkim fragmentima do m/z 911 izmjerena je točna masa, čime se dodatno potvrdio nalaz dobiven pretraživanjem baze podataka SwissProt. Analize triptičkih fragmenata spektrometrom masa Q-TOF poslužile su kao osnova identifikacije pikova u kromatogramima standardne i ispitivanih supstancija rHuINF a-2b. Razvijena je kromatografska metoda u kojoj je svaki pik triptičkog digesta identificiran na temelju izračuna faktora sličnosti ekscitacijskih, emisijskih i UV spektara ispitivane supstancije sa spektrima koji odgovaraju pikovima standardne supstancije. Spektrometrijom masa i kemijskim modifikacijama (jodacetamidom) triptičkih fragmenata s oksidiranim cisteinima, određeni su broj i mjesta nastajanja disulfidnih mostova u makromolekuli rHuINF a-2b. Izoforme rHuINF a-2b razdvojene su 2-D gel-elektroforezom. U gelu je nađeno najmanje osam izoformi od kojih su četiri odgovarale masama rHuINF a-2b s oksidiranim metioninima što je i dokazano analizama triptičkih fragmenata proteina izoliranih iz gela, a četiri dimerima s nasumično spojenim disulfidnim mostovima istih makromolekula. Deamidacija asparagina ili glutamina u triptičkim fragmentima izoliranim iz gela nije zamijećena. Analizama triptičkih fragmenata rHuINF a-2b T14 i T19 tehnikama MS/MS i PSD u potpunosti je određen slijed aminokiselina tek nakon modificiranja fragmenta T-19 s 2-sulfobenzojevom kiselinom i ponovljene analize poslijeionizacijskih iona produkata. Očuvanost trodimenzijske strukture rHuINF a-2b otopljenog u deuteriranim otapalima ispitivana je tijekom 2670 minuta spektrometrijom masa MALDI-TOF. Dobiven je grafički prikaz broja izmijenjenih vodika s deuterijem u vremenu koji je karakterističan za očuvanu i čistu supstanciju.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Kemija

POVEZANOST RADA