ࡱ> y{vwx7 ҃bjbjUU 7|7|l T6T6T686T6  6|77( 8 8 8999$ r99999 8 89BR 8 89&ǒo" 87 P8 H/T6o|DZ06UJDD"  KONDENZAT IZDAHNUTOG ZRAKA Ivana Malo a, Davor Plavec Jedinica za medicinu rada i okoliaa Institut za medicinska istra~ivanja i medicinu rada p.p.291, HR-10001 Zagreb Kontakt osoba: Ivana Malo a, dr.med. Institut za medicinska istra~ivanja i medicinu rada p.p 291, HR-10001 Zagreb E-mail: imaloca@imi.hr Sa~etak: Kondenzat izdahnutog zraka (KIZ) sadr~i aerosoliziran sekret dianih putova i hlapljive sastojke koji pru~aju neinvazivan uvid u biokemijske i upalne procese u pluima. Zna ajan porast interesa za KIZ je rezultat prepoznavanja da u plunim bolestima ta lako sakupljiva tekuina ima mjerljive karakteristike koje se razlikuju od zdravog stanja. KIZ pru~a uvid u redoks reakcije unutar plua, acidobazni status, te stupanj i tip upale u akutnoj i kroni noj fazi astme, kroni noj opstruktivnoj plunoj bolesti, adultnom respiratornom distres sindromu, cisti noj fibrozi i drugim bolestima dianog sustava. Karakteriziran nepoznatom i varijabilnim stupnjevima razrjeenja, KIZ ne pru~a preciznu informaciju o koncentraciji pojedinog markera unutar sekreta dianih putova, ali pokazuje kada se koncentracija razlikuje izmeu zdravog i bolesnog stanja. Zbog pristupa nosti i jednostavnosti izvoenja, KIZ postaje integralni dio buduih klini kih istra~ivanja, a nakon ato se predvlada problem standardizacije on bi se mogao koristiti u dijagnosticiranju i praenju terapije u klini koj praksi. Klju ne rije i: plune bolesti, oksidativni stres, biomarkeri, pH, citokini, hidrogen peroksid Exhaled breath condensate (EBC) contains aerosolized airway lining fluid and volatile compounds that provide noninvasive insight of biochemical and inflammatory activities in the lung. Rapid increase in interest in EBC has arised since the recognition that this easily sampled fluid has measurable characteristics that differ prominently from health. These assays have provided evidence of redox deviation, acid-base status, and degree and type of inflammation in acute and chronic asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis, adult respiratory distress syndrome, and other lung diseases. Because of uncertain and variable degrees of dilution, EBC does not provide precise assessment of individual solute concentrations within native airway lining fluid. However, it can provide information when concentrations differ substantially between health and disease. Because, EBC assays are approachable and easy to perform, theyll become integral components of future clinical studies, and after standardization is accomplished, they might be used to diagnose and monitor therapy in clinical practice. Key words: lung diseases, oxidative stress, biomarkers, pH, cytokines, hydrogen peroxide Bolesti plua i dianog sustava su vrlo este (oko 29% dijagnoza unutar primarne zdravstvene zaatite) (1). To se mo~e objasniti injenicom da diani sustav ima vrlo veliku povrainu izlo~enu krvi i vanjskoj okolini, ime je podlo~an prodoru infektivnih i neinfektivnih imbenika poput duhanskog dima, ispuanih i industrijskih plinova te inhalacijskih alergena. Tako nastale patofizioloake promjene mogue je prou avati razli itim metodama. Osnovne dijagnosti ke metode uklju uju anamnezu, klini ki pregled, slikovni prikaz prsnog koaa (radiogram prsnog koaa, CT plua) i funkcijske plune testove. Nadalje, analiziraju se upalni medijatori iz plazme i urina, ali ti podaci prije reflektiraju sistemsku upalu nego upalu lociranu u dianim putovima. Osim toga, zbog prelijevanja medijatora iz drugih organskih sustava i tako nastalog pozadinskog auma umanjena je osjetljivost i specifi nost dobivenih podataka. Za preciznije informacije o dianom sustavu potrebno je primijeniti poluinvazivne metode kao induciranje sputuma ili invazivne metode poput bronhoskopije sa bronhoalveolarnim lavatom (BAL) i biopsije. S obzirom na njihovu invazivnost one se provode isklju ivo kada postoji jasna indikacija. Treba uzeti u obzir mogunost izazivanja bronhospazma, oateenja sluznice i razrjeenja uzoraka prilikom izvoenja metode ato dovodi do iskrivljenih rezultata. Upravo zbog navedenih nedostataka tih metoda javila se potreba za razvijanjem novog na ina prou avanja lokalnog patoloakog procesa u dianim putovima poput analize izdahnutog zraka. Izdahnuti zrak se sastoji od plinovite faze, koja sadr~i hlapljive spojeve poput duaikovog oksida i uglji nog monoksida, i vodom-zasiene faze koja sadr~i estice aerosola. Kako bi se omoguilo njegovo ispitivanje, izdahnuti zrak je potrebno kondenzirati ime se dobiva tekuina poznata kao kondenzat izdahnutog zraka (KIZ) ije molekule reflektiraju sadr~aj bronhoalveolarnog sekreta (2). Time je omogueno praenje promjena u dianom sustavu uzrokovanih oksidativnim oateenjem i upalom kao i u inke lije enja. Pojam KIZ-a poznat je ve 20-tak godina. Prve studije u kojima su u KIZ-u otkriveni povrainski aktivni sastojci, uklju ujui pluni surfaktant, objavljene su u Rusiji tijekom 80-tih godina (3). Od tada je zamjetan porast publikacija o toj temi, osobito zadnjih desetak godina ato se vidi na slici 1. Meutim, ukupan broj objavljenih studija je joa uvijek ispod 300, a samo neke od njih imaju detaljan osvrt na metodoloaki dio istra~ivanja. Ta injenica ograni avana stvaranje na dokazima utemeljenih smjernica. Grupa ATS/ERS Task Force je u inila prvi korak k standardizaciji objavivai prve smjernice koje e omoguiti neposrednu usporedbu podataka dobivenih iz razli itih centara u buduim istra~ivanjima (4). U ovom pregledu, su predstavljena dosadaanja saznanja o KIZ-u koja su objavljena u stru nim i znanstvenim asopisima na engleskom jeziku. PRIKUPLJANJE KIZ-a Prikupljanje uzoraka KIZ-a je jednostavna i lako izvediva metoda. Vrai se pomou kondenzatora, ureaja koji dopuata neinvazivnu kolekciju neplinovitih komponenti zraka iz izdahnutog zraka. Sakupljanje uzorka se vrai putem oralnog nastavka na kondenzoru. KIZ se mo~e prikupiti i putem nazalne kanile (5) i endotrahealne tube (6,7,8) ime se proairuje krug potencijalnih ispitanika. U veini studija metoda se izvodi na sljedei na in: ispitanika se uputi da diae kroz nastavak za usta koji je spojen na kondenzator. Ne zahtijeva se poseban na in disanja; ak se i izbjegava kako bi se izbjegla potencijalna upala dianog sustava. U veini studija ispitanicima je disanje kroz nos onemogueno atipaljkom. Dva su razloga zaato se preporu a njezino koriatenje to: prvo je ato je viae mogue smanjiti dotok sekreta iz nosnih hodnika u donje diane putove tijekom udisaja; drugo je osigurati da sav izdahnuti zrak izae kroz usta, a ne kroz nos. Meutim joa nema dovoljno podataka koji bi usporedili sastav KIZ-a dobivenog prikupljanjem sa ili bez nosne atipaljke. IMBENICI KOJI UTJE U NA PRIKUPLJANJE KIZ-a Ureaji za prikupljanje kondenzata U veini studija, ureaji za prikupljanje KIZ-a su na injeni unutar laboratorija, te se sastoje od usnika sa jednosmjernom valvulom spojenom na cijev graenu od razli itog materijala (Teflon, polipropilen), (9,10,11) duljina i promjera, ili staklene komore sa dvostrukim zidom (12). Bitno je da je materijal s kojim KIZ dokazi u kontakt kemijski inertan. Slika 2. prikazuje shemu kondenzatora sastavljenog unutar laboratorija. Danas postoje komercijalno dostupni kondenzatori razli itih proizvoa a koji su uglavnom sastavljeni od Teflonom oblo~ene metalne cijevi ohlaene na -20(C. Primjer takvog kondenzatora prikazan je na slici 3. Njima se prevladavaju problemi vezani za standardizaciju na ina disanja, ekspiratornog protoka, duljine, materijala i promjera cijevi. Glavna prednost takvih ureaja je brzo smrzavanje uzorka, ato mo~e biti va~no za kemijski nestabilne komponente poput leukotrijena E4 i 8-izoprostana. U novije vrijeme se proizvode ureaji sa negativnim tlakom za ime je omogueno prikupljanje KIZ-a bez suradnje bolesnika (13). Prednost tih ureaja je u primjeni na sve dobne skupine (prematurusi, starije teako bolesne osobe), u razli itim situacijama (tijekom spavanja ili tijekom noi, tijekom vje~banja ili napora), izbjegavanje kontaminacije slinom i direktno uzorkovanje u komoru za prikupljanje. Trajanje i temperatura kondenzacije Duljina prikupljanja KIZ-a nije jasno definirana. U nekim studijama vrijeme sakupljanja mo~e biti 2 minute (7) dok neki istra~iva i zahtijevaju disanje dulje od jednog sata. Prema veini autora relevantno je uzimanje uzoraka 10 minuta zbog dva prakti na razloga: 1) u tom periodu se kod odraslih i djece starije od 4 godine dobiva oko 1-3 mL kondenzata (za analizu je potrebno najmanje 1 mL); i 2) ta duljina uzimanja ne izaziva umor kod ispitanika. Jedina studija koja je direktno usporeivala utjecaj razli itog vremena prikupljanja je pokazala da nema promjene razine pH u vremenu prikupljanja od 2 i 7 minuta kod zdravih ispitanika (7). U drugim studijama u kojima se KIZ prikupljao 10, 15 i 20 minuta, iako nisu u injene direktne usporedbe, nije bilo razlika u koncentraciji vodikovog peroksida (H2O2), nitrita/nitrata, 8-izoprostana i adenozina. Kondenzacija se mo~e postii na temperaturi oko 0(C ime se dobiva KIZ u tekuem obliku. Koriatenjem ni~ih temperatura pomou razli itih tehnika rezultira prikupljanjem smrznutog materijala. Ovisno o ~eljenoj temperaturi kondenzacije za hlaenje izdahnutog zraka koriste se razli iti mediji poput leda, suhog leda ili tekueg duaika. Problem koji se mo~e javiti kada se za hlaenje koristi tekui duaik ili suhi led je potpuna opstrukcija cijevi za prikupljanje zbog vrlo niskih temperatura (mo~e izazvati hiperinflaciju plua kod mehani ki ventiliranih pacijenata). Koriatenjem vla~nog leda ili duljim prikupljanjem uzorka mo~e se umanjiti broj tih komplikacija. Dob i spol ispitanika Najvea baza podataka o varijablama koje utje u na koncentraciju biomarkera u KIZ-u dostupna je za H2O2. Kod djece koncentracija H2O2 nije ovisna o dobi, meutim kod starije populacije naene su viae razine nego kod mlaih odraslih ispitanika (14,15,16). Te~ina i visina nisu utjecale na koncentraciju H2O2 i volumen KIZ-a kod odraslih ispitanika (17), meutim podaci za ostale medijatore nisu dostupni. Takoer nisu objavljeni podaci o potencijalnom utjecaju rase, spola i polo~aja tijela na koncentraciju biomarkera u KIZ-u. Uzorak se mo~e prikupljati kod djece od 3-4 godine istom metodom kao i za odrasle (15,18). Kod novoroen adi bi se mogla primijeniti maska za lice (19) ili kontinuirana aspiracija nazalnom kanilom (13,20). Problem koji se javlja kod djece je gubitak interesa, zbog ega vrijeme prikupljanja KIZ-a treba svesti na minimum. Na in disanja Volumen KIZ-a ne ovisi o parametrima plune funkcije uklju ujui FEV1 i FVC kod zdravih ispitanika i kod bolesnika sa KOPB-om (17). Za sada nema dokaza koji pokazuju da promjene u kalibru dianih putova uzrokuju razlike u otpuatanju medijatora ili razrjeivanju KIZ-a, ali to pitanje joa nije sistemati no razjaanjeno. Postoje podaci koji otkrivaju da nema promjene u pH KIZ-a nakon akutne opstrukcije dianih putova induciranih metakolinom (7). `to se ti e utjecaja kaalja (spontanog ili induciranog), nema objavljenih podataka o potencijalnom utjecaju na volumen i sadr~aj KIZ-a. Nadalje, valja naglasiti da su koncentracije nekih biomarkera, poput H2O2, ovisne o ekspiratornom protoku, ato upuuje da je podrijetlo te molekule uglavnom iz provodnog dijela dianih putova (11). Utjecaj puaenja Akutna i kroni na izlo~enost duhanskom dimu ima zna ajan utjecaj na H2O2, 8-izoprostan i nitrotirozin (21-25). Kod zdravih ispitanika puaenje uzrokuje poveanje njihovih razina i neutrofilne kemotakti ne aktivnosti, dok nema utjecaj na koncentraciju interleukina-1 ili imbenika tumorske nekroze- (21-25). Kod astmati ara puaenje takoer uzrokuje poviaenje H2O2 (26), dok kod bolesnika sa kroni nom opstruktivnom plunom bolesti (KOPB) nije opa~ena razlika u koncentraciji H2O2 i 8-izoprostana izmeu puaa a i nepuaa a (27-29). Preporuka je da se ispitanik suzdr~i od puaenja najmanje tri sata prije uzimanja uzorka kako bi se sprije io akutni utjecaj puaenja na razinu medijatora. Kontaminacija Kod ove metode je potrebno ato je mogue viae isklju iti problem kontaminacije. Egzogena kontaminacija (iz okoliaa) se isklju uje pravilnom dezinfekcijom kondenzatora. Pod time se podrazumijeva uporaba dezinficijensa koji isparava u cijelosti (npr. peroctena kiselina). Unutraanju kontaminaciju sprje avamo na viae na ina. Potrebno je osigurati da se izdahnuti zrak viae ne vraa sustav. To se posti~e koriatenjem dvosmjerne nepovratnodisajue valvule kod koje su udisaj i izdisaj odvojeni. S obzirom da je pa~nja usmjerena na prikupljanje uzorka iz donjih dianih putova, potrebno je kontaminaciju slinom smanjiti na minimum. U tu svrhu dostupne su nam razli ite tehnike poput posebnog oblika usnika koji ne dopuata cijeenje sline u uzorak, postavljanje kondenzora na viau razinu od usta i odvajanje nastavka za usta od kondenzora duljom cijevi. Ostali na ini su da ispitanici ispiru usta s vodom i/ili gutaju nakupljenu slinu prije davanja uzorka. Za kontrolu kvalitete uzorka s obzirom na kontaminaciju iz sline potrebno je u njemu odreivati amilazu. Nekoliko studija je pokazalo da se uz neku mjeru sprje avanja kontaminacije slinom, amilaza mo~e otkriti samo u manjoj mjeri uzoraka u koncentraciji koja je oko 10,000 puta manja od one u slini (30,31). Meutim, mjerenje amilaze nije specifi no za salivarnu amilazu, a osim toga amilaza se mo~e nai u pluima, tako da pozitivan rezultat testa ne zna i nu~no i kontaminaciju slinom. Mjerenje viskoznosti je takoer je izvoeno, ali zbog slabije osjetljivosti njegova primjena je ograni ena. PRINCIP STVARANJA I SASTAV KIZ-a Princip stvaranja kondenzata je sljedei. Kada zrak napuata gornje diane putove njegova temperatura je 37 (C. Izdahnuti zrak prolazi kroz valvularni blok kod kojeg su udisaj i izdisaj odvojeni. Nakon toga usmjeren je u ohlaenu cijev, lamelarni kondenzator, ija je temperatura od 0 do  20 (C ovisno o na inu hlaenja. Aerosol i ostali neplinoviti sastojci se kondenziraju na unutraanjoj stijenki lamelarnog kondenzatora i kapljice padaju u posudu za prikupljanje uzoraka. KIZ se pohranjuje u hladnjak na -70 (C te mo~e biti naknadno analiziran za razli ite medijatore. Smrznuti kondenzat mo~e biti pohranjen do analize, te ostaje stabilan nekoliko mjeseci (7). Problem nestabilnosti pojedinih sastojaka KIZ-a mogue je rijeaiti dodatkom reagensa za analizu neposredno nakon prikupljanja KIZ-a te pohrana tako stabilnog spoja u hladnjak (32,33). Va~nost prikupljanja i pohrane kondenzata na tamno mjesto kako bi se izbjegla promjena supstanci joa nije istra~ena. KIZ je sa injen od tri komponente. Veinu kondenzata ini vodena para (>99%) koja hlaenjem kondenzira (30). Samo mali udio kondenzata ine nehlapljive molekule koje potje u iz sekreta dianih putova (34). One se dijele na vodotopljive spojeve (npr., amonijak, hidrogen peroksid, etanol) i estice aerosola iz donjih dianih putova (npr., citokini, lipidi, surfaktant, ioni, oksidativni spojevi). Tijekom normalnog disanja, koli ina aerosolnih estica se kree od 0.1 do 4 estica /cm3 srednjeg promjera od 0.3 m (35), iako se ovdje ne ubrajaju najmanje estice, od kojih neke mogu biti prisutne u zna ajnijoj koli ini. Koli ina estica ovisi o brzini zraka i povrainskoj napetosti sekreta (vea brzina i manja napetost dovode do vee proizvodnje aerosola). Turbulencija i vei broj rubova na to kama grananja mogu poja ati stvaranje estica. Mehanizam kojim su estice prisutne u izdahnutom zraku joa uvijek nije jasan. Veina istra~iva a koji se bave prou avanjem KIZ-a pa~nju usmjeruju na upalne medijatore, poput hidrogen peroksida, 8-isoprostana, nitrita, amonijaka, eikosanoida i citokina, te neato manje na nukleinske kiseline. Analiza navedenih spojeva mo~e pru~iti pogled u patofiziologiju plunih bolesti poput astme, cisti ne fibroze (CF), KOPB-a i virusne respiratorne infekcije. U tim stanjima mogue je prou avati egzacerbacijsku fazu bolesti u kojoj se invazivne pretrage rijetko izvode. Takoer je mogue istra~ivati proteine, lipide, DNA i RNA iz mikroorganizama, ime ova metoda postaje dostupna za istra~ivanje mikrobiolozima, geneti arima i farmakolozima. PREDNOSTI I NEDOSTACI KIZ pru~a neinvazivnu procjenu stanja dianog sustava u stvarnom vremenu. Njegove prednosti su navedene u tablici 1. Metoda je jednostavna i visoko reproducibilna (36). Osim toga, KIZ reflektira promjene primijeene drugim invazivnim metodama (37-39). Ne oateuje respiratornu sluznicu te nema dilucijskog imbenika koji je opa~en kod uzoraka dobivenih bronhoskopijom i lava~om. `to se ti e ispitanika tu prakti ki nema ograni enja. KIZ se mo~e primijeniti na osobama koje spontano diau i onima koji se mehani ki ventiliraju. Situacije u kojima se ne izvodi KIZ su jatrogeno uvjetovane (tablica 2). Nadalje, godine nisu limitirajui faktor. KIZ takoer mo~e osigurati sekvencijalno i longitudinalno prikupljanje uzoraka donjih dianih putova bez potrebe za invazivnijim testovima. Iako se joa uvijek primjenjuje samo u istra~ivanjima, kratko vrijeme za prikupljanje uzoraka i potreba za minimalnom kooperabilnoau ine ovu metodu pogodnom za buduu klini ku primjenu u rutinskim pregledima i probirnim testovima. Meutim, metoda ima odreena ograni enja (tablica 1). Joa uvijek nije rijeaen problem standardizacije izvoenja metode s aspekta prikupljanja, pohrane i izbora metoda za odreivanje parametara. Sljedei nedostatak je da se ne zna sa koje razine dianih putova potje u istra~ivani spojevi. Problem oko razli itog razrjeenja i nepostojanje pouzdanog markera dilucije sprje ava pouzdanu procjenu koncentracije markera u sekretu. Meutim, taj se problem javlja i kod induciranog sputuma i kod bronhoalveolarnog lavata. Osim markera koji reflektiraju oksidativni stres, postoji mogunost analiziranja i molekula poput DNA, mikroorganizama koji bi takoer bili korisni u klini koj primjeni. Njihovo istra~ivanje joa uvijek zaostaje za studijama o oksidativnom stresu. Na kraju, mali broj studija je uzrok zaato se ne mogu povui kona ni zaklju ci o korisnosti KIZ-a u klini koj primjeni. BIOMARKERI KOJI SE ANALIZIRAJU U KIZ-u Analiza KIZ-a doprinosi: 1) novijim spoznajama o patoloakim mehanizmima bolesti dianog sustava praenjem promjena razine medijatora; 2) otkrivanju sastava sekreta dianih putova; i 3) koriatenju odreivanih medijatora kao izdahnutih biomarkera respiratornih bolesti. Prema dostupnoj literaturi, naj eai biomarkeri koji se analiziraju su navedeni u tablici 3. Njihovo djelovanje je osobito va~no s aspekta oksidativnog stresa, kojem se pripisuje sve vea uloga u patofiziologiji bolesti dianog sustava. Vodikov peroksid Vodikov peroksid (H2O2) je metaboli ki produkt respiratornog izgaranja prisutan u razli itim vrstama stanica poput neutrofila, eozinofila, makrofaga i epitelnih stanica. Ta hlapljiva molekula se nalazi u detektabilnim koncentracijama u KIZ-u, te ima manju stabilnost u odnosu na ostale markere oksidativnog stresa (npr. izoprostana). Zbog toga je uzorak potrebno odmah nakon prikupljanja, zamrznuti i uvati na d" -70 C do odreivanja njene koncentracije. Zbog injenice da se H2O2 u slini nalazi u 10 do 100 puta veoj koncentraciji nego u KIZ-u, vrlo je va~no sprije iti moguu kontaminaciju uzorka. Naj eae koriatene metode za mjerenje H2O2 u KIZ-u su kolorimetrijska i fluorimetrijska mjerenja, koja se temelje na sposobnosti H2O2 da reagira sa prikladnom supstancom. Izmjerene vrijednosti se zna ajno razlikuju i kod zdravih subjekata i kod bolesnika s razli itim respiratornim bolestima, i veina ih se nalazi blizu donje granice otkrivanja. Prosje ni koeficijent varijabilnosti kroz 21 dan je bio 45% kod bolesnika sa KOPB-om te 43% kod zdravih ispitanika (16). Zbog varijabilnosti, postavlja se pitanje reproducibilnosti odreivanja kolorimetrijskom metodom te primjenjivosti dobivenih podataka kod monitoriranja oksidativnog stresa u dianim putovima. Zbog toga se preporu a koriatenje osjetljivijih metoda odreivanja koncentracije H2O2 kao i provoenje dodatnih studija koje e odrediti korisnost ostalih metoda (npr. kemiluminiscencija ili drugih) za mjerenje H2O2 u KIZ-u. (40-44) Kod zdravih odraslih nepuaa a je primijeena airoka varijabilnost u njegovoj prosje noj koncentraciji koja se kree od 0.01 nM do 0.45 M (14,45). Takav raspon bi se djelomi no mogao objasniti razlikama u prikupljanju uzoraka (npr. razli it stupanj protoka) i analiti kim tehnikama, ime se naglaaava potreba za standardizacijom eksperimentalne metodologije. Nadalje, cikardijurni ritam izdahnutog H2O2, dokazan kod zdravih ispitanika sa najviaim vrijednostima u 12:00 i 24:00 h kao i kod bolesnika sa KOPB-om, takoer doprinosi airini rezultata (14). Referentne vrijednosti izdahnutog H2O2 su objavljene samo za djecu akolske dobi, kod kojih nije naena povezanost izmeu razine H2O2 i dobi, spola, ili plune funkcije (15). Dim cigarete uzrokuje priljev neutrofila i drugih upalnih stanica u donje diane putove i peterostruko viae razine H2O2 su naene kod puaa a u odnosu na nepuaa e (22). Nadalje, poviaene razine su naene kod bolesnika sa astmom (odrasli i djeca)(33,45,46), KOPB-om (28), bronhiektazijama (47,48) i adultnim respiratornim distres sindromom (ARDS) (49), reperfuzijskoj ozljedi (50), alergijskom rinitisu (51), obi noj prehladi (52), postoperativnom periodu nakon resekcije plua (53) i sistemskoj sklerozi (54). U astmi, razine H2O2 su korelirale s brojem eozinofila u induciranom sputumu kao i s bronhalnom reaktivnoau (12). Koncentracije izdahnutog H2O2 dalje rastu kod bolesnika s egzacerbacijom astme (32). Kod bolesnika u egzacerbacijskoj fazi KOPB-a takoer su naene viae razine izdahnutog H2O2 u odnosu na bolesnike u stabilnoj fazi (28) Inhalacijski kortikosteroid, beklometazon (500 (g dva puta dnevno kroz dva tjedna), nije imao utjecaj na razinu H2O2 kod bolesnika sa KOPB-om (55). Kod bolesnika sa egzacerbacijom CF-a, poviaena razina H2O2 pada nakon primjene antibiotika (56). Takav bi podatak mogao pomoi kod praenja lije enja te bolesti. pH pH KIZ-a je indikator acidifikacije dianih putova, koja je rezultat ravnote~e razli itih puferskih sustava i otpuatanja kiselina i baza unutar dianog sustava. pH se mo~e jednostavno mjeriti pH elektrodama i indikatorskim bojama (7,36). Zbog nestabilnosti pH KIZ-a potrebno je izvesti deaeraciju s plinovima bez uglji nog dioksida (poput argona ili duaikovog oksida). Tijekom deaeracije, pH postepeno raste do to ke kada se mo~e postii stabilno o itanje (pri tome, se viae ne mo~e ukloniti uglji ni dioksid deaeracijom). Kod zdravih ispitanika, pH KIZ-a nakon deaeracije ima prosje an pH od 7.7, a raspon normalnih vrijednosti se smatra od 7.4 do 8.8. Prosje ni dnevni i tjedni koeficijent varijabilnosti kod zdravih subjekata iznosi izmeu 4,5% i 3,5% (7). Izdahnuti pH ne podlije~e salivarnoj, nazalnoj, i ~elu anoj kontaminaciji i nije pod utjecajem opstrukcije dianih putova. Razina pH nije pod utjecajem duljine i na ina prikupljanja i pohrane, dobi ispitanika, pH sline, izazvanoj hiperventilaciji ili hipoventilaciji (7). Takoer, pH kondenzata nije pod utjecajem amonijaka iz usne aupljine (57). Meutim uzimanje hrane ili pia sa hlapljivim kiselinama (ocat) mo~e utjecati na test i do dva sata nakon ingestije. Mjerenje pH je izuzento osjetljiv test, a i cijena izvoenja je prihvatljiva. Acidifikacija dianih putova objaanjava patologiju astme, ali i drugih bolesti dianih putova. Za razliku od odrasle populacije, kod djece sa akutnom astmom nije doalo do pada pH KIZ-a, niti do njegove promjene tijekom lije enja egzacerbacije (58). U Huntovoj studiji, pH KIZ-a od pacijenata s akutnom astmom je bio ni~i (5.23) od kontrolnih subjekata (7.65) te se normalizirao tijekom kortikosteroidne terapije (36). Drugi istra~iva i su otkrili sli an u inak kod KOPB-a i bronhiektazija (59). Nadalje, razine pH su bile povezane s eozinofilnom i neutrofilnom upalom dianih putova (59). Nedavna studija je utvrdila ni~i pH KIZ-a kod klini ki stabilnih CF pacijenata (5.8) u odnosu na zdrave subjekte (6.1), kao i daljnje smanjivanje pH kod CF pacijenata tijekom akutne plune egzacerbacije (5.2) (60). Ta opa~anja poveavaju mogunost da je kiseli okolia dianih putova dio patofiziologije CF-a. pH KIZ-a se zna ajno poveava nakon terapije antibiotikom, ali ne dosti~e kontrolne razine. U drugoj studiji je izmjeren ni~i pH kod ne-CF bronhiektati nih pacijenata kroni no zara~enih s Pseudomonas aeruginosa, u odnosu na one koji nisu zara~eni (59). Leukotrijeni Nekoliko studija se bavi istra~ivanjem razine leukotrijena u KIZ-u, osobito usmjerujui pa~nju na kemotakti an LTB4 i cisteinil leukotrijene (cys-LT: LTC4, LTD4, i LTE4) zbog njihove poznate uloge u patofiziologiji astme. Cys-LT se prvenstveno proizvode u mastocitima i eozinofilima te izrazito poti u kontrakciju glatkih miaia dianih putova, poveavaju krvo~ilnu propusnost i mukoznu hipersekreciju, te mijenjaju mukocilijarni klirens, djelovanja koja su va~na u patofiziologiji bronhalne opstrukcije. LTB4 je jaki aktivator neutrofila, koji bi mogao doprinijeti oticanju dianih putova stvarajui lokalni edem i poveavajui mukoznu sekreciju (61). Cys-LT i LTB4 se mjere enzimskom imunokemijskom metodom (EIA, od engl. enzyme immunoassay) ija je granica detekcije 15 pg/mL i 4.4 pg/mL (62-70). Raspon cys-LT koncentracija kod zdravih ispitanika u KIZ-u je izmeu 0 i 25 pg/mL, a LTB4 izmeu 0 i 220 pg/mL (63-71). Specifi nost imunoreaktivnosti LTB4je potvrena HPLC metodom (od engl. high-performance liquid chromatography) (72). Prosje ni dnevni koeficijent varijabilnosti za LTB4 kod zdravih subjekata iznosi 2%. (63). LTB4 i cys-LT su poviaeni kod pacijenata sa stabilnom umjerenom i teakom astmom (73). Nadalje, poviaene koncentracije cys-LT naene tijekom egzacerbacijske faze astme kod djece su se snizile nakon lije enja prednizolonom (64). LTB4 je poviaen kod pacijenata sa stabilnim KOPB-om te dalje raste u egzacerbaciji dok mu se razine spuataju nakon antibiotskog lije enja (67) Carpagnano i suradnici su nedavno otkrili da je LTB4 zna ajno poviaen u KIZ-u CF pacijenata tijekom akutne egzarcerbacije u odnosu na kontrolne subjekte (68). Nitrati i nitriti Nitriti (NO2-) i nitrati (NO3-) su kona ni produkti metabolizma duai nog oksida prisutni u sekretu dianih putova (74). U KIZ-u su mjereni spektrofotometrijskom metodom (Griessova reakcija) i fluorimetrijskom metodom (2,3-diaminonaftalen (DAN) reakcija) te kemiluminiscentnim testovima. Objavljena granica detekcije kod DAN testa je 0.1 M a kod Griessove reakcije neato viaa (75,76). NO2- se u KIZ-u nalazi u koncentraciji oko 1 M, ato je blizu granici otkrivanja za navedene testove. Kod interpretacije vrijednosti NO2-, treba uzeti u obzir da on nije stabilan pri niskom pH, pa ak i pri neutralnom pH. NO3- se smatra stabilnim. Nadalje, duaikovi oksidi su prisutni na laboratorijskoj povraini, uklju ujui stakleno posue i pipete. Zbog toga, istra~iva i bi trebali biti oprezni kako bi sprije ili kontaminaciju uzorka. Predlo~eno je da se svaki materijal koji dolazi u kontakt s KIZ-om detaljno ispere visoko pro iaenom (destiliranom/deioniziranom) vodom. To ispiranje je najbolje u initi neposredno prije uporabe, zbog injenice da lako difuzibilan NO iz okoliaa postaje oksidiran i brzo kontaminira povrainu. NO2- je u odnosu na zdrave nepuaa e poviaen kod pacijenata s teakom astmom, KOPB-om, bronhiektazijama, CF-om te kod akutne ozljede plua (77,78,79). Puaenje uzrokuje akutno poveanje NO3-, ali ne i NO2- u KIZ-u (23). Kod bolesnika s egzacerbacijom astme, viae NO2- razine su zabilje~ene u odnosu na stabilne bolesnike, a lije enje s inhalacijskim steroidima rezultira zna ajnim smanjenjem njegove koncentracije (80,81). Izdahnuti NO2- je takoer poviaen kod odraslih (77) i djece (76) sa CF-om u odnosu na kontrolnu skupinu. `to se ti e NO3-, objavljeni su dvosmisleni rezultati upuujui na nepromijenjenu ili poviaenu razinu u razli itim stanjima dianog sustava (59,82). 8-izoprostan 8-izoprostan nastaje peroksidacijom arahidonske kiseline reakcijom kataliziranom slobodnim radikalima, zbog ega se smatra markerom oksidativnog stresa (83). Njegova prisutnost u KIZ-u zdravih osoba upuuje na prisutnost "fizioloakih" razina oksidativnog stresa. Veina studija za njegovo mjerenje koristi komercijalno dostupne enzimske imunokemijske testove s granicom otkrivanja od 3,9 pg/mL (66,67,84,85,86) Osjetljivija i specifi nija metoda je plinska kromatografija/spektrometrija masa (GC/MS, od engl. gas chromatography/mass spectometry). Koriatenjem te metode Carpenter je naaao 8-izoprostan samo kod nekih zdravih ispitanika (87) dok je Moloney naaao detektabilne razine te molekule kod svih testiranih subjekata (8). U odnosu na zdrave pojedince, izdahnuti 8-izoprostanje poviaen kod pacijenata sa stabilnom astmom, a poveanje korelira s te~inom astme i stupnjem upale (84). Montuschi i suradnici su u studiji pokazali da su razine 8-izoprostana bile udvostru ene u blagoj astmi u odnosu na zdrave osobe, dok su u teakoj astmi bile utrostru ene (84). Unato  lije enju oralnim i/ili viaim dozama inhalacijskim steroidima, bolesnici s teakom astmom su imali visoke razine 8-isoprostana ato upuuje da kortikosteroidi nemaju u inak na inhibiciju oksidativnog stresa (84). Izdahnuti 8-izoprostan je takoer povean kod puaa a i bivaih puaa a sa KOPB-om (24) Sli ne vrijednosti 8-izoprostana u KIZ-u kod puaa a i bivaih puaa a sa KOPB-om bi mogle upuivati da je oksidativni stres uzrokovan kroni nim puaenjem dosegao to ku kada prestanak puaenja ima mali, ili nikakav u inak (24). Nije postojala povezanost izmeu 8-isoprostana i funkcijskih plunih testova kod pacijenata s astmom ili KOPB-om (24,84). Koncentracija 8-izoprostana je takoer poviaena kod pacijenata sa CF-om, te njegova razina negativno korelira sa FEV1 kod istih bolesnika (86). Najviae apsolutne vrijednosti izdahnutog 8-izoprostana su naene u akutnoj ozljedi plua/ARDS-u, ato reflektira teki oksidativni stres povezan sa tim sindromom (87). Metaboliti arahidonske kiseline Danas je malo poznato o prostaglandinima u KIZ-u. Iako PGE2 bi mogao imati zatitnu ulogu u inhibiciji bronhokonstrikcije i aktivnosti upalnih stanica, on bi takoer mogao imati i proinflamatorno djelovanje (88). PGE2 se mo~e mjeriti enzimskim imunokemijskim testovima i radioimunitestovima (RIA) (73,89-92). Granica otkrivanja za PGE2 je 8 pg/mL (92). PGE2 je prisutan u KIZ-u zdravih pojedinaca (73) te je poviaen kod pacijenata sa stabilnim KOPB-om (93). Kod tih pacijenata koncentracija PGE2 korelira s izdahnutim LTB4, upuujui na injenicu da ato je vea upala plua to je vea produkcija endogenih antiinflamatornih medijatora poput PGE2. Neselektivna COX- inhibicija oralnim ibuprofenom smanjuje izdahnuti PGE2 kod KOPB bolesnika (94). Uzimajui u obzir protektivnu ulogu PGE2 u pluima, taj u inak bi mogao biti va~an pri modulaciji upale dianih putova kod KOPB-a. U inak selektivnog COX-2 inhibitora (rofekoksib) na izdahnuti PGE2 i kod KOPB pacijenata nije poznat. Ostale molekule KIZ sadr~i ostale molekule/obilje~ja koji mogu pru~iti va~nu informaciju uklju ujui p53 mutaciju (95,96), DNA (34,97), hepatocitni imbenik rasta (98), vitronektin, endotelin (99) i kemotakti nu aktivnost (100). Kod bolesnika s atopijskom astmom su primjeeni manjak magnezija i porast kalcija u KIZ-u (101). Kod bolesnika s CF-om koncentracija cinka je bila poviaena u odnosu na kontrolnu skupinu, dok se koncentracije natrija i klora nisu zna ajno razlikovale (102). Mjerenje i identifikacija proteina u KIZ joa uvijek predstavljaju kontroverzno podru je. Visoke koncentracije ukupnih proteina su primjeene kod mladih puaa a u odnosu na nepuaa e (100). Prikupljanje KIZ-a bi takoer moglo biti korisno za brzo otkrivanje infektivnih procesa u pluima pomou PCR tehnologije, poput tuberkuloze (97,103) Citokini Do sada je u KIZ-u otkriveno nekoliko citokina, iako su neki od njih poput IL-8 otkriveni kod malo ispitanika a vrijednosti esto uklju uju nulu. (34,104-110). Koncentracije citokina u uzorcima KIZ-a se obi no mjere EIA/ELISA kitovima. Potreban je oprez kod primjenjivanja tih metoda zbog injenice da je koncentracija nekih citokina prisutna oko donje granice detekcije. Kako bi se predvladao taj problem uzorci se mogu koncentrirati prije mjerenja. Dnevni koeficijent varijacije za IL-6 iznosi 5,9% kod zdravih ispitanika (68). Poviaene razine IL-4 i sni~ene razine interferona- su opisane kod astmati ne djece (106). Lije enje kortikosteroidima je bilo povezano sa zna ajnom redukcijom IL-4 i poviaenom razinom interferona-. IL-6 je naen poviaen kod bolesnika s karcinomom plua (107), KOPB-a (108), CF(68) i puaa a (109). Ishemija- reperfuzija se povezuje s poviaenjem IL-10 u KIZ-u (110). IL-1 je takoer otkriven u KIZ-u (100). Adenozin Adenozin je produkt raspadanja adenozin trifosfata te ima airoko podru je djelovanja na diani sustav putem svojih specifi nih receptora (111). U KIZ-u se mjeri HPLC metodom. Granica otkrivanja te metode iznosi 2 nmol/l. Raspon vrijednosti adenozina kod zdravih ispitanika je izmeu 0 i 20 nmol/L. Prosje an dnevni koeficijent varijabilnosti iznosi 10% kod zdravih ispitanika (31). Njegova razina u KIZ-u je poviaena kod bolesnika s alergijskim rinitisom (89) i astmati ara s posljedi nim preklapanjem izmeu zdravih vrijednosti u oba stanja (31). Kod bolesnika s pogoraanjem simptoma astme, koncentracija adenozina u KIZ-u je bila viaa od stabilne faze bolesti. (31) Sa~etak analize medijatora Medijatori /obilje~ja KIZ-a predstavljaju airok raspon varijabli od protona do DNA fragmenata. Zbog njihovog razli itog biokemijskih obilje~ja (hlapljivost, stabilnost, molekularna te~ina, itd.) svaki od njih zahtijeva posebno razmatranje u kontekstu mjerenja njihove prisutnosti u KIZ-u. Prema dosadaanjim spoznajama mjerenje pH KIZ-a je najlakae i najreproducibilniji test za analizu KIZ-a. Sustavi za analizu su esto ograni eni zbog injenice da su biomarkeri prisutni u niskim koncentracijama, tako da ograni enje testa doprinosi varijabilnosti uzorka. Validacija pojedina nih biomarkera u KIZ-u je sporiji proces, u odnosu na validaciju izdahnutog NO prvenstveno zbog injenice da KIZ sadr~i mnoge komponente koje se mogu prou avati. ZAKLJU AK: Mjerenja upalnih medijatora u KIZ-u osiguravaju pogled u patofiziologiju bolesti plunog sustava. Najvea prednost ovog testa o ituje se u ovim injenicama: (1) u cijelosti neinvazivan; (2) lako izvediv; (3) prikladan za ponavljana mjerenja upale tijekom stabilne i/ili egzacerbacijske faze plunih bolesti i (4) potencijalno koristan za procjenu u inkovitosti pojedinih lijekova. Karakterizacija profila izdahnutih markera, poput eikosanoida, bi mogla biti va~na u diferencijalnoj dijagnozi upalnih plunih bolesti. Meutim, potrebno je razjasniti nekoliko metodoloakih tema, poput standardizacije prikupljanja uzoraka i validacije analiti kih tehnika. Nadalje, studije o u inkovitosti lijekova na KIZ markere su naj eae opa~ajne te su potrebne kontrolirane studije koje e potvrditi njihovu primjenu u voenju lije enja upalnih bolesti dianog sustava. Budua istra~ivanja u ovom podru ju uklju uju: (1) odreivanje referentnih vrijednosti razli itih upalnih biomarkera kod zdrave populacije; (2) studije reproducibilnosti mjerenja; (3) velike longitudinalne studije; (4) mogue povezanosti KIZ markera sa simptomima i znakovima plune funkcije, te ostalih metoda za kvantifikaciju upale dianih putova; i (5) istra~ivanja mehanizama stvaranja KIZ-a i njegove povezansoti sa sekretom dianog sustava. Kada e ova metoda biti klini ki dostupna teako je predvidjeti. Meutim, zbog va~nosti upale u patofiziologiji mnogih plunih bolesti poput astme, KOPB-a, i relativni nedostatak neinvazivnih metoda za monitoriranja upale dianih putova i terapijske intervencije, potrebna su daljnja istra~ivanja na tom podru ju. Literatura: 1. http://www.hzjz.hr/epidemiologija/kron_bol.htm 2. Mutlu GM, Garey KW, Robbins RA, Danziger LH, Rubinstein I. Collection and Analysis of Exhaled Breath Condensate in Humans. Am J Respir Crit Care Med 2001;164: 731-7. 3. Sidorenko GI, Zborovskii EI, Levina DI. Surface-active properties of the exhaled air condensate (a new method of studying lung function). Ter Arkh 1980;52(3):65-8. 4. Horvath I, Hunt J, Barnes PJ On behalf of the ATS/ERS Task Force on Exhaled Breath Condensate. Exhaled breath condensate: methodological recommendations and unresolved questions. Eur Respir J 2005; 26: 523-48. 5. Griese M, Noss J, von Bredow C. Protein pattern of exhaled breath condensate and saliva. Proteomics 2002;2(6):690-6. 6. Gessner C, Hammerschmidt S, Kuhn H, Seyfarth HJ, Sack U, Engelmann L, i sur. Exhaled breath condensate acidification in acute lung injury. Respir Med 2003;97(11):1188-94. 7. Vaughan J, Ngamtrakulpanit L, Pajewski TN, Turner R, Nguyen TA, Smith A, i sur. Exhaled Breath Condensate pH is a robust and reproducible assay of airway acidity. Eur Respir J 2003; 22: 889-94. 8. Moloney ED, Mumby SE, Gajdocsi R, Cranshaw JH, Kharitonov SA, Quinlan GJ, i sur. Exhaled breath condensate detects markers of pulmonary inflammation after cardiothoracic surgery. Am J Respir Crit Care Med 2004;169(1):64-9. 9. Kietzmann D, Kah R, Muller M, Burchardi H, Kettler D. Hydrogen peroxide in expired breath condensate of patients with acute respiratory failure and with ARDS. Intensive Care Med 1993; 19: 7881. 10. Sznajder JI, Fraiman A, Hall JB, Sanders W, Schmidt G, Crawford G, i sur. Increased hydrogen peroxide in the expired breath of patients with acute hypoxemic respiratory failure. Chest 1989; 96: 60612. 11. Schleiss MB, Holz O, Behnke M, Richter K, Magnussen H, Jorres RA. The concentration of hydrogen peroxide in exhaled air depends on expiratory flow rate. Eur Respir J 2000;16:1115-8. 12. Horvath I, Donnelly LE, Kiss A, Kharitonov SA, Lim S, Chung KF, i sur. Combined use of exhaled hydrogen peroxide and nitric oxide in monitoring asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158:104210. 13. Griese M., Latzin P, Beck J. A non-invasive method to collect nasally exhaled air condensate in humans of all ages. Eur J Clin Invest 2001;31:915-20. 14. Nowak D, Kalucka S, Bialasiewicz P, Krol M. Exhalation of H2O2 and thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) by healthy subjects. Free Radic Biol Med 2001;30:17886. 15. Jobsis Q, Raatgeep HC, Schellenkes SL, Hop WCJ, Hermans PWM, de Jongste JC. Hydrogen peroxide and nitric oxide in exhaled air of healthy children: reference values. Eur Respir J 1998;12:483-5. 16. Van Beurden WCJ, Dekhuijzen PNR, Harff GA, Smeenk FWJM. Variability of exhaled hydrogen peroxide in stable COPD and matched healthy controls. Respiration 2002; 69: 2116. 17. Gessner C, Kuhn H, Seyfarth H-J, Pankau H, Winkler J, Schauer J, I sur. Factors influencing breath condensate volume. Pneumologie 2001; 55: 4149. 18. Baraldi E, Ghiro L, Piovan V, Carraro S, Zacchello F, Zanconato S. Safety and success of exhaled breath condensate collection in asthma. Arch Dis Child 2003; 88:35860. 19. Cheah FC, Darlow BA, Winterbourn CC. Problems associated with collecting breath condensate for the measurement of exhaled hydrogen peroxide from neonates on respiratory support. Biol Neonate 2003; 84:33841. 20. Latzin P, Beck J, Bartenstein A, Griese M. Comparison of exhaled breath condensate from nasal and oral collection. Eur J Med Res 2003; 8: 50510. 21. Guatura SB, Martinez JA, Santos Bueno PC, Santos ML. Increased exhalation of hydrogen peroxide in healthy subjects following cigarette consumption. Sao Paulo Med J 2000; 118: 938 22. Nowak D, Antczak A, Krol M, Pietras T, Shariati B, Bialasiewicz P, i sur. Increased content of hydrogen peroxide in the expired breath of cigarette smokers. Eur Respir J 1996; 9: 6527. 23. Balint B, Donnelly LE, Hanazawa T, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate after exposure to tobacco smoke. Thorax 2001;56:456-61. 24. Montuschi P, Collins JV, Ciabattoni G, Lazzeri N, Corradi M, Kharitonov SA, i sur. Exhaled 8-isoprostane as an in vivo biomarker of lung oxidative stress in patients with COPD and healthy smokers. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162:1175-7. 25. Garey KW, Neuhauser MM, Rafice AL, Robbins RA, Danziger LH, Rubinstein I. Protein, nitrite/nitrate, and cytokine concentration in exhaled breath condensate of young smokers [abstract]. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161:A175 26. Horvath I, Donnelly LE, Kiss A, Balint B, Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled nitric oxide and hydrogen peroxide concentrations in asthmatic smokers. Respiration 2004; 71: 4638. 27. Nowak D, Kasielski M, Antczak A, Pietras T, Bialasiewicz P. Increased content of thiobarbituric acidreactive substances and hydrogen peroxide in the expired breath condensate of patients with stable chronic obstructive pulmonary disease: no significant effect of cigarette smoking. Respir Med 1999; 93: 38996. 28. Dekhuijzen PN, Aben KK, Dekker I, Aarts LP, Wielders PL, van Herwaarden CL, i sur. Increased exhalation of hydrogen peroxide in patients with stable and unstable chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1996;154:813-6. 29. Nowak D, Kasielski M, Pietras T, Bialasiewicz P, Antczak A. Cigarette smoking does not increase hydrogen peroxide levels in expired breath condensate of patients with stable COPD. Monaldi Arch Chest Dis 1998; 53: 268267. 30. Effros RM, Hoagland KW, Bosbous M, Castillo D, Foss B, Dunning M, I sur. Dilution of respiratory solutes in exhaled condensates. Am J Respir Crit Care Med 2002; 65: 6639. 31. Huszar E, Vass G, Vizi E, Csoma Z, Barat E, Molnar Vilagos G, i sur. Adenosine in exhaled breath condensate in healthy volunteers and in patients with asthma. Eur Respir J 2002; 20: 13938. 32. Dohlman AW, Black HR, Royall JA. Expired breath hydrogen peroxide is a marker of acute airway inflammation in pediatric patients with asthma. Am Rev respir Dis 1993;148:955-60. 33. Jobsis Q, Raatgeep HC, Hermans PW, de Jongste JC. Hydrogen peroxide in exhaled air is increased in stable asthmatic children. Eur Respir J 1997;10:519-21. Scheideler L, Manke HG, Schwulera U, Inacker O, Hammerle H. Detection of nonvolatile macromolecules in breath. A possible diagnostic tool? Am Rev Respir Dis 1993; 148: 77884. 35. Fairchild CI, Stampfer JF. Particle concentration in exhaled breath. Am Ind Hyg Assoc J 1987; 48: 948-9. 36. Hunt JF, Fang K, Malik R, Snyder A, Malhotra N, Platts-Mills TA, Gaston B. Endogenous airway acidification: implications for asthma pathophysiology. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 694-9. 37. Arias-Diaz J, Vara E, Torres-Melero J, Garcia C, Baki W, Ramirez-Armengol JA i sur. Nitrite/nitrate and cytokine levels in bronchoalveolar lavage fluid of lung cancer patients. Cancer 1994;74:1546-51. 38. Pheng LH, Francoeure C, Denis M. The involvement of nitric oxide in a amouse model of adult respiratory distress syndrome. Inflammation 1995;19:599-610. 39. Kanazawa H, Shoji S, Yamada M, Fujii T, Kawaguchi T, Kudoh S, i sur. Increased levels of nitric oxide derivates in induced sputum in patients with asthma. J Allergy Clin Immunol 1997;99:624-9. 40. De Benedetto F, Aceto A, Dragani B, Spacone A, Formisano S, Cocco R, i sur. Validation of a new technique to assess exhaled hydrogen peroxide: results from normals and COPD patients. Monaldi Arch Chest Dis 2000; 55: 1858. 41. Van Beurden WJ, Harff GA, Dekhuijzen PN, van den Bosch MJ, Creemers JP, Smeenk FW. An efficient and reproducible method for measuring hydrogen peroxide in exhaled breath condensate. Respir Med 2002; 96: 197203. 42. Zappacosta B, Persichilli S, Mormile F, Minucci A, Russo A, Giardina B, i sur. A fast chemiluminescence method for hydrogen peroxide measurement in exhaled breath condensate. Clin Chim Acta 2001; 310: 18791. 43. Razola SS, Ruiz BL, Diez NM, Mark HB Jr, Kauffmann JM. Hydrogen peroxide sensitive amperometric biosensor based on horseradish peroxidase entrapped in a polypyrrole electrode. Biosens Bioelectron 2002; 17: 9218. 44. Thanachasai S, Rokutanzono S, Yoshida S, Watanabe T. Novel hydrogen peroxide sensors based on peroxidasecarrying poly[pyrrole-co-[4-(3-pyrrolyl)butanesulfonate] copolymer films. Anal Sci 2002; 18: 7737. 45. Antczak A, Nowak D, Shariati B, Krol M, Piasecka G, Kurmanowska Z. Increased hydrogen peroxide and thiobarbituric acid-reactive products in expired breath condensate of asthmatic patients. Eur Respir J 1997;10:1235-41. 46. Emelyanov A, Fedoseev G, Abulimity A, Rudinski K, Fedoulov A, Karabanov A, i sur. Elevated concentrations of exhaled hydrogen peroxide in asthmatic patients. Chest 2001;120:1136-9. 47. Loukides S, Bouros D, Papatheodorou G, Lachanis S, Panagou P, Siafakas NM. Exhaled H2O2 in steady state bronchiectasis: relationship with cellular composition in induced sputum, spirometry, and extent and severity of diseases. Chest 2002;121:81-7. 48. Loukides S, Horvath I, Wodehouse T, Cole PJ, Barnes PJ. Elevated levels of expired breath hydrogen peroxide in bronchiectasis. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 991-4. 49. Wilson WC, Swetland JF, Benumof JL, Laborde P, Taylor R. General anesthesia and exhaled breath hydrogen peroxide. Anesthesiology 1992; 76: 703-50. Wilson WC, Laborde PR, Benumof JL, Taylor R, Swetland JF. Reperfusion injury and exhaled hydrogen peroxide. Anesth Analg 1993; 77: 96370. 51. Sandrini A, Ferreira IM, Jardim JR, Zamel N, Chapman KR. Effect of nasal triamcinolone on lower airway inflammatory markers in patients with allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol 2003; 111: 31320. 52. Jobsis Q, Schellenkens SL, Fakkel-Kroesbergen A, Raatgreep HC, de Jongste JC. Hydrogen peroxide in breath condensate during a common cold. Mediators Inflam 2001; 10: 3514. 53. Lases EC, Duurkens VA, Gerritsen WB, Haas FJ. Oxidative stress after lung resection therapy: a pilot study. Chest 2000; 117: 9991003. 54. Luczynska M, Szkudlarek U, Dzianowska-Bartkowiak B, Waszczykowska E, Kasielski M, Sysa-Jedrzejowska A, i sur. Elevated exhalation of hydrogen peroxide in patients with systemic sclerosis. Eur J Clin Invest 2003; 33: 2749. 55. Ferreira IM, Hazari MS, Gutierrez C, Zamel N, Chapman KR. Exhaled nitric oxide and hydrogen peroxide in patients with chronic obstructive pulmonary disease: effects of inhaled beclomethasone. Am J Respir Crit Care Med. 2001;164:1012-15. 56. Jobsis Q, Raatgeep HC, Schellenkes SL, Kroesbergen A, Hop WC, de Jongste JC. Hydrogen peroxide and nitric oxide in exhaled air of children with cystic fibrosis during antibiotic treatment. Eur Respir J 2000;16:95-100. 57. Wells K, Vaughan J, Pajewski TN. Exhaled breath condensate pH assay not influenced by oral ammonia. Thorax 2005;60:27-31. 58. MacGregor G, Ellis S, Andrews J, Imrie M, Innes A, Greening AP, i sur. Breath condensate ammonium is lower in children with chronic asthma. Eur Respir J 2005; 26: 271 - 6. 59. Kostikas K, Papatheodorou G, Ganas K, Psathakis K, Panagou P, Loukides S. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. Am J Respir Crit Care Med 2002, 165:136470. 60. Tate S, MacGregor G, Davis M, Innes J, Greening A. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax 2002;57:926-9. 61. Claesson HE, Odlander B, Jakobssen PJ. Leukotriene B4 in the immune system. Int J Immunopharmacol 1992;14:441-9. 62. Reinhold P, Becher G, Rothe M. Evaluation of the measurement of leukotriene B4 concentrations in exhaled condensate as a noninvasive method for assessing mediators of inflammation in the lungs of calves. Am J Vet Res 2000; 61: 7429. 63. Csoma Zs, Kharitonov SA, Balint B, Bush A, Wilson NM, Barnes PJ. Increased leukotrienes in exhaled breath condensate in childhood asthma. Am J Respir Crit Care Med 2002; 166: 13459. 64. Baraldi E, Carraro S, Alinovi R, Pesci A, Ghiro L, Bodini A, i sur. Cysteinyl leukotrienes and 8-isoprostane in exhaled breath condensate of children with asthma exacerbation. Thorax 2003; 58: 5059. 65. Bodini A, Peroni D, Vicentini L, Loiacono A, Baraldi E, Ghiro L, i sur. Exhaled breath condensate eicosanoids and sputum eosinophils in asthmatic children: a pilot study. Pediatr Allergy Immunol 2004; 15: 2631. 66. Zanconato S, Carraro S, Corradi M, Alinovi R, Pasquale MF, Piacentini G, i sur. Leukotrienes and 8-isoprostane in exhaled breath condensate of children with stable and unstable asthma. J Allergy Clin Immunol 2004; 113: 25763. 67. Biernacki WA, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased leukotriene B4 and 8-isoprostane in exhaled breath condensate of patients with exacerbation of COPD. Thorax 2003; 58: 2948. 68. Carpagnano GE, Barnes PJ, Geddes DM, Hodson ME, Kharitonov SA. Increased leukotriene B4 and interleukin-6 in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167:110912. 69. Neubauer B, Struck N, Mutzbauer TS, Schotte U, Langfeldt N, Tetzl K. Leukotriene-B4 concentrations in exhaled breath condensate and lung function after thirty minutes of breathing technically dried compressed air. Int Marit Health 2002; 53: 93101. 70. Becher G, Winsel K, Beck E, Neubauer G, Stresemann E. Leukotriene B4 in breathing condensate of patients with bronchopulmonary diseases and of normal patients. Appl Cardiopulmon Pathophysiol 1995; 5: 2159. 71. Sandrini A, Ferreira IM, Gutierrez C, Jardim JR, Zamel N, Chapman KR. Effect of montelukast on exhaled nitric oxide and nonvolatile markers of inflammation in mild asthma. Chest 2003; 124: 133440. 72. Montushci P, Ragazzoni E, Valente S, Corbo G, Mondino C, Ciappi G, i sur. Validation of leukotriene B4 measurements in exhaled breath condensate. Inflamm Res 2003; 52: 6973. 73. Montuschi P, Barnes PJ. Exhaled leukotrienes and prostaglandins in asthma. J Allergy Clin Immunol 2002;109(4):615-20. 74. Van der Vliet, Eiserich JP, Shigenaga MK, Cross CE. Reactive nitrogen species and tyrosine nitration in the respiratory tract: epiphenomena or a pathobiologic mechanism of disease? Am J Respir Crit Care Med 1999;160:1-9. 75. Balint B, Kharitonov SA, Hanazawa T, Donnelly LE, Shah PL, Hodson ME, i sur. Increased nitrotyrosine in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur Respir J 2001; 17: 12017. 76. Cunningham S, McColm JR, Ho LP, Greening AP, Marshall TG. Measurement of inflammatory markers in the breath condensate of children with cystic fibrosis. Eur Respir J 2000; 15: 9557. 77. Ho LP, Innes JA, Greening AP. Nitrite levels in breath condensate of patients with cystic fibrosis is elevated in contrast to exhaled nitric oxide. Thorax. 1998;53:680-4 78. Gessner C, Hammerschimdt S, Kuhn H, Lange T, Engelmann L, Schauer J, i sur. Exhaled breath condensate nitrite and its relation to tidal volume in acute lung injury. Chest 2003; 124: 104652. 79. Ganas K, Loukides S, Papatheodorou G, panagou P, Kalogeropoulos N. Total nitrite/nitrate in expired breath condensate of patients with asthma. Resp Med 2001;95:649-54. 80. Hunt J, Byrns RE, Ignarro LJ, Gaston B. Condensed expirate nitrite as a home marker for acute asthma. Lancet 1995; 346: 12356. 81. Kharitonov SA, Donnelly LE, Montuschi P, Collins JV, Barnes PJ. Dose-dependent onset and cessation of action of inhaled budesonide on exhaled nitric oxide and symptoms in mild asthma. Thorax 2002; 57: 88996. 82. Corradi M, Pesci A, Casana R, Alinovi R, Goldoni M, Vettori MV, i sur. Nitrate in exhaled breath condensate of patients with different airway diseases. Nitric oxide 2003; 8: 2630. 83. Janssen LJ. Isoprostanes: an overview and putative roles in pulmonary pathophysiology. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001;280:1067-82. 84. Montuschi P, Corradi M, Ciabattoni G, Nightingale J, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased 8-Isoprostane, a Marker of Oxidative Stress, in Exhaled Condensate of Asthma Patients. Am J Respir Crit Care Med 1999;160:216-20. 85. Montuschi P, Ciabattoni G, Paredi P, Pantelidis P, du Bois RM, Kharitonov SA, i sur. 8-Isoprostane as a biomarker of oxidative stress in interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 15247. 86. Montuschi P, Kharitonov SA, Ciabattoni G, Corradi M, van Rensen L, Geddes DM, i sur. Exhaled 8-isoprostane as a new non-invasive biomarker of oxidative stress in cystic fibrosis. Thorax 2000; 55:2058-9. 87. Carpenter CT, Price PV, Christman BW. Exhaled breath condensate isoprostans are elevated in patients with acute lung injury or ARDS. Chest 1998;114:1653-9. 88. Pavord ID, Tattersfield AE. Bronchoprotective role for endogenous prostaglandin E2.Lancet 1995;334:436-8. 89. Vass G, Huszar E , Barat E, Valyon M, Kiss D, Penzes I, i sur. Comparison of nasal and oral inhalation during exhaled breath condensate collection. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167: 8505. 90. Antczak A, Montuschi P, Kharitonov SA, Gorski P, Barnes PJ. Increased exhaled cysteinyl-leukotrienes and 8-isoprostane in aspirin-induced asthma. Am J Respir Crit Care Med 2002; 166: 3016. 91. Montuschi P, Ragazzoni E, Valente S, Corbo G, Mondino C, Ciappi G, i sur. Validation of 8-isoprostane and prostaglandin E2 measurements in exhaled breath condensate. Inflamm Res 2003; 52: 5027. 92. Kostikas K, Papatheodorou G, Psathakis K, Panagou P, Loukides S. Prostaglandin E2 in the expired breath condensate of patients with asthma. Eur Respir J 2003; 22: 7437. 93. Montuschi P, Kharitonov SA, Carpagnano E, Culpitt S, Russell R, Collins JV, i sur. Exhaled prostaglandin E2: a new biomarker of airway inflammation in COPD. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161:A821. 94. Montuschi P. Non selective cyclooxygenase inhibition decreases exhaled prostaglandin E2 in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2001;163, A908 95. Gessner C. Detection of mutations of the K-ras gene in condensed breath of patients with non small cell lung cancer (NSLC) as a possible non-invasive screening method. Pneumologie 1998; 52: 4267. 96. Gessner C, Kuhn H, Toepfer K, Hammersmidt S, Schauer J, Wirtz H. Detection of p53 mutations in exhaled breath condensate of non small cell lung cancer patients. Lung Cancer 2004; 43: 21522. 97. Vogelberg C, Hirsch T, Rosen-Wolff A, Kerkmann M-L, Leupold W. Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia cannot be detected by PCR in the breath condensate of patients with cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 2003; 36: 34852. 98. Nayeri F, Millinger E, Nilsson I, Zetterstrom, Brudin L, Forsberg P. Exhaled breath condensate and serum levels of hepatocyte growth factor in pneumonia. Respir Med 2002; 96: 1159. 99. Carpagnano GE, Kharitonov SA, Wells A, Pantelidis P, Du Bois RM, Barnes PJ. Increased vitronectin and endothelin-1 in the breath condensate of patients with fibrosing lung disease. Respiration 2003; 70: 15460. 100. Garey K, Neuhauser MM, Robbins RA, Danziger LH, Rubinstein I. Markers of inflammation in exhaled breath condensate of young healthy smokers. Respiration 2004;71:463-8. 101. Emelianov AV, Petrova MA, Lavrova OV, Guleva LI, Dolgodvorov AF, Fedoseev GB, i sur. Disorders in mineral metabolism at different stages of the development of bronchial asthma. Terapevticheski Archiv 1995;67:45-7. 102. Griese M, Noss J, Schramel P. Elemental and ion composition of exhaled air condensate in cystic fibrosis. J Cystic Fibrosis 2003; 2:136-42. 103. Schreiber J, Meyer C, Rusch-Gerdes S, Richter E, Beck H, Fischer JF, i sur. Mycobacterium tuberculosis gene-amplification in breath condensate of patients with lung tuberculosis. Eur J Med Res 2002; 7: 2901. 104. Ho LP, Faccenda J, Innes JA, Greening AP. Expired hydrogen peroxide in breath condensate of cystic fibrosis patients. Eur Respir J 1999; 13: 1036. 105. Carpagnano GE, Kharitonov SA, Resta O, Foschino- Barbaro MP, Gramiccioni E, Barnes PJ. Increased 8-isoprostane and interleukin-6 in breath condensate of obstructive sleep apnea patients. Chest 2002; 122:11627. 106. Shahid SK, Kharitonov SA, Wilson NM, Bush A, Barnes PJ. Increased interleukin-4 and decreased interferon-c in exhaled breath condensate of children with asthma. Am J Respir Crit Care Med 2002; 165: 12903. 107. Carpagnano GE, Resta O, Foscino-Brabaro MP, Gramiccioni E, Carpagnano F. lnterleukin-6 is increased in breath condensate of patients with non-small cell lung cancer. Int J Biol Markers 2002; 17: 1415. 108. Bucchioni E, Kharitonov SA, Allegra L, Barnes PL. High levels of interleukin-6 in the exhaled breath condensate in patients with COPD. Respir Med 2003; 97: 1299302. 109. Carpagnano GE, Kharitonov SA, Foschino-Barbaro MP, Resta O, Gramiccioni E, Barnes PJ. Increased inflammatory markers in the exhaled breath condensate of cigarette smokers. Eur Respir J 2003; 21: 58993. 110. McRae K, De Perrot M, Fischer S, Waddell TK, Liu M, Keshavjee S. Detection of IL-10 in the exhaled breath condensate, plasma and tissue during ischemiareperfusion injury in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant 2001; 20: 184. 111. Fozard JR. The case for a role for adenosine in asthma: almost convincing? Curr Opin Pharmacol 2003; 3: 2649. Tablica 1. Prednosti i nedostaci KIZ-a Prednostijednostavna, pristupa na metoda, mo~e se koristiti izvan zdravstvene ustanove (npr. akola, radna mjesta)visoko reproducibilna ne oateuje respiratornu mukozu i isklju en je imbenik razrjeivanja dostupna airokom spektru pacijenata longitudinalno prikupljanje uzorakaanaliza nehlapljivih spojeva koji su povezani se plunom patofiziologijom Nedostacijoa uvijek nedovoljna standardizacija uzimanja uzorka nedostatak dokaza o podrijetlu estica aerosola nije provedeno dovoljno istra~ivanja o korelaciji koncentracije markera u uzorku i u dinim putovima manja poznata korist analize biomarkera koji nisu vezani za oksidativni stres mali broj studija  Tablica 2. Uvjeti u kojima se KIZ ne izvodi Ako je u prethodnom tjednu bila izveden pregled bronhalnog sustava (BAL, biopsija), zbog injenice da sama invazivnost tih metoda mo~e dovesti do promjene sastava sekreta.Ako su prije tri dana izvoeni specifi ni ili nespecifi ni bronhalni provokacijski testovi zato ato bi oni mogli dovesti do upalnih promjenaU slu aju izvoenja forsiranog disanja i testova sa fizi kim optereenjem treba pri ekati do 10 minuta prije uzimanja KIZ-a  Tablica 3. Naj eae prou avani markeri SkupinaMarkeriBolestiMetaboliti arahidonske kiseline Leukotrijen B4Neutrofilne bolesti plua--KOPB, Akutna astma, Cisti na fibroza, Bronhiektazije, Pneumonija, ARDSLeukotrijen C4, D4, E4AstmaProstaglandin E4AstmaIzoprostani (8-isoPGF2alpha)Respiratorne bolesti sa oksidativnim stresom u podlozi--astma, KOPB, bronhiektazije, ARDSProteiniECP/EPXAstmaInterleukini (IL-1Beta, IL-4,IL-2,IL-6,Il-8)Sve respiratorne bolestiTNF-(Opi marker upale. Va~an kod mnogih bolestiAmilazaMarker kontaminacije slinom. Takoer mo~e reflektirati stvaranje amilaze u donjim dianim putovimaNukleinske kiselineDNA (pomou PCR)Karcinom plua, potencijalan marker za procjenu mutacija. RNA (pomou RT-PCR)Istra~ivanje ekspresije gena, otkrivanje odreenih virusaVazaoaktivni peptidi, aminiAcetilkolin Va~an kod astme, vjerojatno kod KOPB-aKatekolaminiNepoznatoHistaminAstmaSerotoninNepoznatoManje molekuleTiobarbituri ni kiseli reaktivni spojeviVeina plunih bolestiH2O2Veina plunih bolestiNitratAstma, KOPB, Bronhiektazije, Cisti na fibroza, puaenje, ARDSNitritAstma, KOPB, Bronhiektazije, Cisti na fibroza, puaenje, ARDSNitrotirozinAstma, KOPB, Bronhiektazije, Cisti na fibroza, puaenje, ARDSUreaPotencijalan marker dilucijeAmonijakHipersenzitivni indikator niskog pHKlorid ostali elektrolitiMogue za CF i ostale bolesti. Potencijalan marker dilucije.pHAstma, KOPB, Bronhiektazije, Cisti na fibroza, ARDS, infekcija rinovirusomSurfaktantAstma, Bolest nezrelih plua, ARDSOctena kiselinaAstma, infekcija rinovirusomMlije na kiselinaNepoznatoMravlja kiselinaNepoznatoAdenozinAstma, KOPB i puaa i PAGE 1 PAGE 38 6p"X Bp|Rx!"##$+,,D,4444(5996<:<??FFFFFFFFKKLLLLLLLL8N䣝CJH* 5CJ\ jCJ CJH*\CJ\CJH*mHsH jCJmHsH \mHsHCJOJQJ^J6CJ\]mHsHCJ\mHsHCJOJQJ^JCJ\ CJmHsHmHsHCJOJQJ\^J768np"TVXxBprtz|~d` dd1$[$\$ dd1$[$\$$a$ʃЃ(RTVXZ\^`bdfh$da$d`hjlnprtx!x%+,,D,4444(5???vFKd` $ yda$dddd$da$d`KKKO|R~RR$WXXX*^,^H^^j`jj*r^y~~~~v$da$d$da$d$da$d`d`d8N:N>?3@ABBdCDD}EEFGgH?I hd7$8$H$^h $hd^ha$CFEFHHJKK3K4KK>N?NNNNAOkOlOO&PQQQQQQQqR3SS8U9UUUVaW7XHXXYYZ]@]g]^Oc{cc+dddeeekkklnnuv۾۹۹ۧ5CJ\mHsH5CJmHsHmHsHCJhmHsH0J5CJ\CJaJCJH*mHsH CJmHsHCJB*CJaJmH phsH B*CJaJ mH phsH >?I&JJKLuM?NNlONPQQqR4SSdT9UUVaW7XYYZZ[d\ $hd^ha$ hd7$8$H$^hd\]]^c_&`aabOc+dde-fgghRi"jkkkkkkk$da$ $hd^ha$ hd7$8$H$^hkkkkkkkkkkkkkkkkX$$Ifl J!064 la$If$a$$da$kllmmmmmm(n*nnnnnn` ,$If$a$X$$Ifl J!064 la$ & F$If^`a$nnHoJooo=p>ppppppp@P}xx$a$$ & F $If^`a$$ & F$If^`a$X$$Ifl J!064 la pppppppppppppppppppppppppppppp$a$pp2s4sPtRtLuNuPuRuTuVuXuZu\u^u<a$$Ifl 6`064 la$ & F$&`#$/Ifa$$a$^u`ubudufuhujulunupurutuvuxuzu|u~uuuuuuuuuuuuuu$a$uuuuuuuuvv"v$vfvvHwL  9r $If$IfW$$If;FB    6    4a $$Ifa$$a$vvv"v$vdvfvvvvFwHwJwLwNwzw|wwwwwwwwwwwwwwwxxxxxxxxxxxx>y@ypyrytyvyxyyyyyyyyyyyzzzzz{{~{{{{{{{ jaCJmHsHCJPJmHsHCJH*mHsH5CJPJ\mHsH CJmHsH5CJ\mHsH5CJPJ\aJmHsHIHwJwNw|wwwwwwKhW$$IfFB    6    4a$IfW$$IfFB    6    4awwwwxxxxxK`W$$IfFB    6    4a$IfW$$IfFB    6    4axxx@yrytyxyyy$KW$$IfFB    6    4a$IfW$$IfFB    6    4ayyyyzzz{z{KW$$IfFB    6    4a$IfW$$IfFB    6    4az{|{~{{{{{"|$|DKDW$$IfFB    6    4aW$$IfFB    6    4a$If{ |"|$|Z|\|r|t|||||||||||||}}}}} }"}4}6}H}J}L}h}j}}}}}}}}}}}}}&~(~*~,~.~:~<~~~~~~~~FHJLNfh,.024DCJH*\mHsHCJ\mHsH5CJPJ\mHsH5CJ\mHsHCJPJmHsH CJmHsHO$|\|t|||||||hKHW$$IfFB    6    4aW$$IfFB    6    4a$If||}}}"}6}J}L}\K@W$$IfFB    6    4aW$$IfFB    6    4a$IfL}j}}}}}}(~*~|K W$$IfFB    6    4aW$$IfFB    6    4a$If*~.~<~~~~~HJ K8W$$IfFB    6    4aW$$IfFB    6    4a$IfJNh.0KW$$IfFB    6    4aW$$IfFB    6    4a$If04FȀBDHNhDW$$IfFB    6    4a$If DFƀȀ@BDFHLNDFHJLjl΂Ђ   "$&68`bƒăЃ҃0JmHnHu0J j0JU5CJPJ\mHsH5CJ\mHsH CJmHsHCJPJmHsHDFHLlKW$$IfFB    6    4a$IfW$$IfFB    6    4aЂ  "&8b|x$IfW$$IfFB    6    4a bdfhjlnprtvxz|~$a$W$$IfFB    6    4aăƃȃʃ̃΃Ѓ҃h]h&`#$$a$. A!"#$% i0@0 Normal_HmH sH tH:@: Heading 1$$@&a$5CJTT Heading 2$<@& 56CJOJQJ\]^JaJNN Heading 3$<@&5CJOJQJ\^JaJBB Heading 4$<@&5CJ\aJP@P Heading 5$$@&a$5CJOJQJ\^JmHsH>@> Heading 6$$@&a$ CJmHsH>@> Heading 7$@&5CJ\mHsH<A@< Default Paragraph Font(U@( Hyperlink>*B*, @, Footer  9r &)@& Page Number,/", List^`0220 List 26^6`20B2 List Bullet  & F:DR: List Continuex^*B@b* Body Textx0ar0 Reference Line@P@@ Body Text 2$a$CJ\mHsH6Q@6 Body Text 3 CJmHsHNC@N Body Text Indent$`a$ CJmHsH>V@> FollowedHyperlink >*B* phll fulltext-referencesdd[$\$$CJOJPJQJ^JaJmH sH tH RR@R Body Text Indent 2$`a$ CJmHsH"W@" Strong5\ZS@Z Body Text Indent 3$h^ha$CJhmHsHtH 78\!89:=>?@ABCDEFGHIJKLMNWP  "CDpq;#%%%'>)?)M)+W,X,h,//$//505Q59<??@?V?ICFFFGHHNQSaT}U V#V6[]___'d9f:fMfjKmLmYm2p[r tt@uAuau6vv4y5yEy{{l|m|v|~ !*ƂǂƅDž҅*!"#$%&'()5gwYp .ŗrFܙR ֟͠_$٣x(Z'ħlD¬[W(3d޷}g?&ٽu?lNq4d9a7dc&O+-R">?VW4567AByzbcvwxyz{|}~no{|}~yz|-.7?EFHu12FW78:GQRT]cdfpz{124;yz|9vwy| ()+=GHJ[efhqH00000X00\0\0\0\0\0\0\X00!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!@0!@0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!0!H00000Dh0D0q0q0000000000000000000005005005005H0050@?0@?H005H0050F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F0F00:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f0:f00m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|0m|* 0m|0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r@0r@0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0r@0r@0r@0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0r@0r@0r@0r@0r@0r@0r@0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r0r@0r 0r@0r 0r@0r 0r@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q@0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0q0@0@0@0@0@0@0 000 8Nt CFv{D҃hKvd "4?Id\kknpp^uuHwwxyz{$||L}*~J0b҃Ѓ !T!TOb$sS&+>R$#Y@>H]3$2$u#0]G636^@0(  B S  ?"(06 !#')7XbRZip{&(alP S T Y [ _ ` h j s t z | S`0#9#>O@OIOKO3P?PRRRRRSSSSSSTETSTqV{V|VVVVVVVVVVVVVV?WIWWWWWX)XSX]XZ"Z6[C[\&\/\7\\\I]U]X]d]p_{_L`M`P```JbMbkbybbbbbbbbbbbbbbb*c,c-c/cGcIcJcLccctc.d1ddddddeOe\eeeMfTffffff gg%g*g9gMg_gggggggiijajljjkkkllfmmmnm|mmmmmKnWnnnnnnno!o"o?o@oDonoyo}ooooooooooooooooooooooooopppppppppp"p#p,pZp\phpppppqqqrr$r6r@rArMrsssntvtyuuuuuuv$vUvcvpvvvvvvRwZw]wgwwwwxxx]xhxxxxxIyOyPyVyyyyyyyyyyyyz zzzzz'z*z4z5z;zz?zIzJzPzQzZz[z\z{z~zzzzzzzz{${%{&{'{5{E{H{I{O{P{]{^{j{{{m|u|||$},}}}}}~~~~~~ALMNR\"KOqr}@SZdO^gq@J‰Ӊdrˊjoty~njȌΌόٌڌ܌݌!+06;BCIJTUWX[\cdghrvyzōɍ͍Ӎ !'(24BCRSVWabkmpqwŽɎʎЎюێ܎ߎ#'+38<@IT[\bcmn{|~Ϗӏۏ "$'-.12>?DEGHNOVX[\bzːҐӐِڐ#$+-/289=\eilz#+07fghk $(.367DEGHPQYZ\]dehipt~˓ՓHNOStz”ŔƔДєӔԔڔ۔ݔޔ".26:DEGMPQ_`demnxzĕȕЕՕ  &',-/078;<>?FGO[acfgm29EMSYhouxɗЗԗٗݗWZv{(,JP\gkqǙʙǚ˚ךۚܚݚ589?V\muyǛțқӛ؛ٛ#(26=AHLVbilw{}~œÜʜ˜ҜԜٜ֜ߜ "3;@JW^hkltuȝɝ͝ Ǟ˞מ ڟ!-67ABDEMNVWYZbcghnors{|ڠ ơˡҡ9?@Dcjw{ (/49>DIPQWX`aijlvxy~ãģǣݣ  !#$+,/023<=?@FGPQY[^_ex ,5:BGOP]^`ahioqstwx{|ťɥϥХեڥ,.039:>^cdhtz{¦ŦƦΦϦզ֦ئ٦ +05?CHLOP[\^_efklnqw~ȧЧԧ٧ݧ  !'(-.78:;BCIJLMUVZ[aelmqryŨɨΨҨӨԨר)0DKWZt{&,HRVaelpw#15BDFOp|ͫԫիTflsƬͬѬ֬ڬ $%()78<=EFNOQRYZ`aklnoxyȭ̭ԭح#$,-/09:BDI_gkquƮǮծ׮  !'(+,4578@BG[cgnr{Ưǯɯʯدگܯ߯ ").59?KUVYZabhiqrz|ʰҰ ,4EKPUu±ʱֱڱ۱'+4<Cò̲Ѳղ7@DNRgkx|"'-?DT[\bchilmuv~´ɴʴشڴܴߴ "-2=IKLSX`aijmntuz{}~Ƶȵ˵̵ҵ #',-01;<>?CDKMShq $15:>GKRV^eghopvw  &'/4=?HIKLSTZ[egmĸŸ˸͸иӸ 6A˹ι/;syz~źɺκҺغܺݺ޺kqu{ͻػ&-CLPW[bfm~ *38B\gݽ %&1589DGIJQRXYcdfgmnvxz}Ⱦ;Ծؾ¿ʿοؿܿ$FJKWXdyCLPY]dhmqx| "#&'5689?KOPWtwx}+126RX\fks  ()+,4578@DKLRSXZ`u|8=AIMZ^eiwhr=DHMQW[bfmqx}~<KRYho !"$%+,468;ABFenr|;DHRWaeltz~ "+078>?IJUZbcefnostyz~ '-37=IOSTUX -Cv|}GNORhpt#-2<@Gbcip  '9;<DEIJQR]^ghoqsv|}FQgnz*3PX^eu(7BDJNV%0luTXY^ov{06:>BJNWX[`klnovwz{ ux2<AKPUYacjoz  "39Wafpu 39[d#)nrswx68[\ !7NVWP  !"BDoq:#;#%%%%''=)?)L)M)++V,X,g,h,//#/$/.505P5Q599<<>?@?U?V?HCICFFFFGGHHHHNNQQSS`TaT|U}UV V"V#V5[6[]]____ccc&d'd8f:fLfMfjjJmLmXmYmmmmVoYooo2pZr[rt ttt?uAu`uau5v6vvv3y5yDyyyzzzzz{t{{{{k|m|u|v|~~!)*łǂŅDžх҅)* )45fgvwXՒCEp ~-ėRq(EۙR .}~̠֟46#$أ٣w(YZ&'çħDké%&CT̫ͫgl¬Z[VWְװ̱Hٲ2cݷ޷|}¹Ĺ%mnpOf>%ؽٽ%>A\`DJEp34Jc 8t}` 7),qsGcFb%DKO*+uBDJ3Q!n=?UW37@Bxzacumozx|,.67>?DHtu02EFVW6:FGPT\]bfopy{04:;x|89uy{| '+<=FJZ[dhpq33333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333NNWW~ ""%%M)M)h,h,$/$/Q5Q5V?V?FFHH V V҅҅$)IMI=C:\Documents and Settings\DELL\My Documents\KIZ\KIZ2 0408.docIMI=C:\Documents and Settings\DELL\My Documents\KIZ\KIZ2 0408.docIMI=C:\Documents and Settings\DELL\My Documents\KIZ\KIZ2 0408.docIMIaC:\Documents and Settings\DELL\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of KIZ2 0408.asdIMIaC:\Documents and Settings\DELL\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of KIZ2 0408.asdIMIaC:\Documents and Settings\DELL\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of KIZ2 0408.asdIMIaC:\Documents and Settings\DELL\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of KIZ2 0408.asdIMIaC:\Documents and Settings\DELL\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of KIZ2 0408.asdIMIaC:\Documents and Settings\DELL\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of KIZ2 0408.asdIMIaC:\Documents and Settings\DELL\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of KIZ2 0408.asd*f4^Xm8' JH  K Jb5 |0<4[ j0<Mw OO! s%#0hbk:$ϬXy*&d0*@Rb{+ .G-nu\0Jp).0>~ [^'1\~-:o2,:~:x nEkc=6fQ<> AjqvAGg>jE`v/N(Il"p5J %Kw[*N g%PnTrPV OX *Z V2 b  eb_kb |i}0SUS. hh^h`OJQJo(^`.^`.p^p`.@ ^@ `.^`.^`.^`.^`.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L. hh^h`OJQJo(hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L. hh^h`OJQJo(h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L.h^`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L.h ^`OJQJo(h ^`OJQJo(oh pp^p`OJQJo(h @ @ ^@ `OJQJo(h ^`OJQJo(oh ^`OJQJo(h ^`OJQJo(h ^`OJQJo(oh PP^P`OJQJo( hh^h`OJQJo(h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.h ^`OJQJo(h ^`OJQJo(oh pp^p`OJQJo(h @ @ ^@ `OJQJo(h ^`OJQJo(oh ^`OJQJo(h ^`OJQJo(h ^`OJQJo(oh PP^P`OJQJo(h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L.hh^h`o(.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L.h ^`OJQJo(h ^`OJQJo(oh pp^p`OJQJo(h @ @ ^@ `OJQJo(h ^`OJQJo(oh ^`OJQJo(h ^`OJQJo(h ^`OJQJo(oh PP^P`OJQJo(h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L." ^`B*o(ph.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L. hh^h`OJQJo(hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L.hhh^h`.h88^8`.hL^`L.h  ^ `.h  ^ `.hxLx^x`L.hHH^H`.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L. hh^h`OJQJo(h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.Jhh^h`o(.h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.^`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L. hh^h`OJQJo(hh^h`. hh^h`OJQJo(hh^h`.h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L. hh^h`OJQJo(h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.h^`.h^`.hpLp^p`L.h@ @ ^@ `.h^`.hL^`L.h^`.h^`.hPLP^P`L.*PV5JkbO!Q<>V2 bOX*ZH {+/'[*Nbk:$).0Mwg%PK eb/N(Inu\05 ^[ :~:ASUS0*:o2.G-[^'1Xy*|i}g>jEqvA%Ks%#nT|kc=**                                                                                                                                                         8dl                                                                                                   @ @ @/5GDž>?VW457AByzbcvwxno{|yz|-.7?EFHu12FW78:GQRT]cdfpz{124;yz|9vwy| ()+=GHJ[efhq@@{ #'/7IJKMPQRU]defhptuvwxy~ @,4<FN^n@4@ln@rtvxUnknownG: Times New Roman5Symbol3& : Arial?5 z Courier NewI& ??Arial Unicode MS;Wingdings"1 h"Y} !tcw=!20d֌ 2QPRIKUPLJANJE IKZKatarina JankoviIMIOh+'0  0 < H T`hpxPRIKUPLJANJE IKZoRIKKatarina Jankovićata Normal.dotnIMI125Microsoft Word 9.0@Y@.@ؘ@e!t՜.+,0 hp|  IMIc PRIKUPLJANJE IKZ Title  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdeghijklmopqrstuzRoot Entry F 8|1TableDWordDocumentSummaryInformation(fDocumentSummaryInformation8nCompObjjObjectPool 8 8  FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.89q