Naslov
Izolacija i svojstva nativnog goveđeg transferina i njegovih terminalnih fragmenata
(Isolation and properties of native bovine serum transferin and its terminal fragments)

Autori
Huzjak, Dražen

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, magistarski rad

Fakultet
Prehrambeno-biotehnološki fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
07.06

Godina
1996

Stranica
154

Mentor
Boris Mildner

Ključne riječi
tranferin; goveđa plazma; izolacija; radioimunokemijsko ispitivanje
(transferin; bovine plasma; isolation; radioimmunoassay)

Sažetak
Transferin iz goveđe plazme postaje komercijalno vrlo interesantan kao jeftina zamjena za transferin iz humane plazme u kemijski definiranim podlogama za uzgoj stanica u kulturi. Premda je transferin bio predmet brojnih istraživanja mnoga njegova fizikalno-kemijska, biokemijska a posebno imunokemijska svojstva još uvijek nisu u potpunosti objašnjena. Radi potpunog objašnjavanja tih svojstava istraživanja je potrebno provesti s čistim transferinom kod kojeg je maksimalno sačuvana prirodna struktura a time i biološka svojstva. Za tu svrhu razvijena je jednostavna i brza metoda za izolaciju transferina iz goveđe plazme koja predstavlja kombinaciju metode selektivnog taloženja proteina iz goveđe plazme PEG-om i korekcijom pH, te dodatno pročišćavanje transferina metodama kromatografije na ionskim izmjenjivačima (DEAE- i CM-Sepharose FF). Opisanom metodom može se dobiti elektroforetički čisti transferin (97, 6%) uz iskorištenje od oko 74%. Ispitivanja koja su zatim provedena uglavnom su bila usmjerena na određivanje utjecaja vezanja željeza na imunokemijska svojstva goveđeg transferina, kao i na utvrđivanje imunokemijskih razlika između aktivnih središta za vezanje željeza na molekuli transferina. U cilju dobivanja pročišćenih antitransferinskih antitijela za imunokemijska ispitivanja goveđeg transferina provedena je imunizacija kunića s transferinom izoliranim iz goveđe plazme. Iz dobivenog antiseruma izolirana su imunoafinitetnom kromatografijom specifična antitijela. Nosač za imunoafinitetnu izolaciju pripremljen je kovalentnim vezanjem pročišćenog goveđeg transferina na glutaraldehidom aktivirani Ultrogel AcA 22. Imunoelektroforetičke analize su pokazale da pročišćena antitijela pripadaju G-klasi imunoglobulina iz kunićjeg seruma i da reagiraju jedino s goveđim transferinom. Radioimunokemijska ispitivanja su pokazala da konformacijske promjene do kojih dolazi tijekom vezanja željeza na goveđi transferin ne utječu značajnije na njegovu imunogenost. U cilju određivanja imunokemijskih razlika između aktivnih središta za vezanje željeza provedena je ograničena proteoliza željezom zasićenog goveđeg transferina pomoću imobiliziranog tripsina. Iz dobivenog proteolizata kromatografijom na ionskom-izmjenjivaču DEAE-Sepharose FF i gel filtracijom na Sephadex G-75 raqzdvojeni su i pročišćeni N- i C-terminalni fragmenti sa sačuvanim aktivnim središtima za vezanje željeza. Rezultati radioimunokemijskih ispitivanja su pokazali da poliklonska antitransferinska antitijela reagiraju s oba terminalna fragmenta ali sa slabijim afinitetom u odnosu na nativni transferin. Pri tome je afinitet antitijela veći prema N-terminalnom fragmentu nego prema C-terminalnom fragmentu. Ova razlika u afinitetu vjerojatno je posljedica razlike u broju epitopa koje prepoznaju antitransferinska antitijela kao i njihove očuvanosti. pri tome N-terminalni fragment ima veći broj epitopa koje prepoznaju antitijela ali su kod C-terminalng fragmenta ona bolje sačuvana nakon proteolize. Konačno, dobiveni rezultati ukazuju na to da se imunokemijske razlike između aktivnih središta za vezanje željeza mogu dovesti u vezu s razlikama u brzini kojom aktivna središta otpuštaju željezo stanicama. Naime, poput antitransferinskih antitjela i transferinski receptori imaju veći afinitet prema zasićenomnativnom transferinu nego prema njegovim terminalnim fragmentima. Zbog togas je nativni transferin i najefikasniji dobavljač željeza stanicama. Između terminalnih fragmenata s aktivnim središtima za vezanje željeza, N-terminalni fraqgment je bolji dobavljač željeza, jer transferinski receptori jednako kao i antitransferinska antitijela imaju veći afinitet prema N-terminalnom nego prema C-terminalnom fragmentu.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Kemija, Biologija, Biotehnologija

POVEZANOST RADA