Naslov
Genetska transformacija duhana i krumpira analozima gena "squash" inhibitora tripsina za postizanje otpornosti na insekte
(Genetic transformation of tobacco and potato plants for insect resistance using analogues of the squash trypsin inhibitor gene)

Autori
Kereša, Snježana

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, doktorska disertacija

Fakultet
Agronomski fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
05.07

Godina
2002

Stranica
99

Mentor
Barić, Marijana

Ključne riječi
squash tripsin inhibitori; sintetski geni; transformacija biljaka; duhan; krumpir; otpornost na kukce; entomološki testovi; Spodoptera littoralis
(squash trypsin inhibitors; synthetic genes; plant transformation; tobacco; potato; insect resistance; entomological tests; Spodoptera littoralis)

Sažetak
U svrhu dobivanja biljaka otpornih na štetne kukce, u duhanu kao model biljci i krumpiru eksprimirano je 12 različitih sintetskih gena, analoga gena "squash" inhibitora tripsina. Ispitana je stabilnost integracije transgena u genomsku DNA, ekspresija u T0 i T1 generaciji biljaka te su provedeni entomološki testovi u svrhu utvrđivanja učinkovitosti eksprimiranih proteinaznih inhibitora na smanjenje rasta gusjenica sovice Spodoptera littoralis. Geni su dizajnirani prema aminokiselinskoj sekvenci squash inhibitora tripsina, a razlikovali su se samo u kodovima za aminokiseline u reaktivnom mjestu (P1- P1') i mjestu vezanja inhibitora (P4'). U tim mjestima kombinirane su aminokiseline specifične za inhibitore tripsina iz različitih biljnih vrsta. Geni su sintetizirani uz pomoć Klenow DNA polimeraze i dugih primera koji su bili komlementarni i nalijegali jedan na drugog svojim 3' krajevima. Za transformaciju je korištena bakterija Agrobacterium tumefaciens soj EHA 105 s rekombinantnim pBI121 vektorima. Geni su eksprimirani pod utjecajem 35S promotora. Ukupno je uzgojeno 265 biljka duhana i 107 biljaka krumpira transformiranih različitim konstruktima. PCR analizom uz pomoć genomske DNA transformiranih biljaka i primera koji naliježu na promotorsku i terminacijsku sekvencu, utvrđena je stabilna integracija transgena u analiziranim biljkama. Isto je potvrđeno hibridizacijom DNA metodom po Southernu u biljkama T1 generacije. RT-PCR analiza potvrdila je uspješnost prvog stupnja ekspresije mini gena u uzgojenim transformiranim biljkama. cDNA amplificirana od mRNA sintetskih gena analizirana u 2% agaroznom gelu pokazala je očekivanu dužinu od 105 pb. U entomološkim testovima hranjenja gusjenica ispitan je utjecaj transformiranih T0 biljaka duhana i krumpira, kao i netransformiranih kontrolnih biljaka na rast gusjenica S. littoralis. Analiza varijance vrijednosti mase preživjelih gusjenica provedena je s ciljem utvrđivanja utjecaja različitih aminokiselina u P1, P1' i P4' mjestima inhibitora i njihovih različitih kombinacija na redukciju rasta gusjenica. Velik dio varijabilnosti mase gusjenica bio je uzrokovan faktorom biljka, tj. razinom ekspresije inhibitora u regeneriranim biljkama, što je posljedica pozicijskog učinka (mjesta ugradnje gena u biljni genom). Samo aminokiselina u P1' mjestu pokazala je značajan utjecaj na redukciju mase gusjenica. Duncan-ovim testom je utvrđeno da su od triju različitih aminokiselina korištenih u P1' mjestu mini inhibitora Ile i Ser jednako učinkoviti u smanjenju rasta gusjenica, dok aminokiselina Asp na tom mjestu smanjuje učinkovitost inhibitora. Uspoređujući Duncan-ovim testom samo po jednu, najveću vrijednost redukcije mase gusjenica po inhibitoru, najučinkovitijim u duhanu pokazao se inhibitor KIK s kombinacijom aminokiselina Lys-Ile Lys u P1-P1' i P4' mjestu inhibitora, što je karakteristično za CSTI-IIb. Gusjenice S. littoralis hranjene listovima jedne od biljaka koje su eksprimirale inhibitor KIK postigle su na kraju eksperimenta svega 26% mase gusjenica hranjenih kontrolnim biljkama. Gotovo jednaka inhibicija rasta gusjenica postignuta je biljkama koje su eksprimirale inhibitore RIE i RIK s aminokiselinama Arg-Ile Glu i Arg-Ile Lys u P1-P1' i P4' tipičnim za CMTI-I i CMTI-III. Vrlo slično postignuto je inhibitorima s aminokiselinama Lys- Ser Glu, Lys-Ile Glu i Arg-Ser Glu u P1-P1' i P4' mjestima. Analizom i ovog seta podataka potvrđena je najslabija inhibicija rasta gusjenica inhibitorima koji u P1' mjestu imaju aminokiselinu Asp. Redukcija rasta gusjenica hranjenih listovima transgenog krumpira potvrdila je da je i u krumpiru moguće eksprimirati gene proteinaznih mini inhibitora na razini koja štetno utjeće na rast gusjenica S. littoralis. Određivanje inhibitorne aktivnosti biljnog soka duhana T1 generacije protiv goveđeg tripsina pokazalo je evidentno opravdanu višu inhibitornu aktivnost biljnog soka tranformiranih biljaka u odnosu na kontrolu. Ovo potvrđuje ekspresiju mini inhibitora i u generativnom potomostvu primarnih transformanata.

Izvorni jezik
Hrvatski, engleski

Znanstvena područja
Poljoprivreda (agronomija), Biotehnologija

POVEZANOST RADA