Naslov
Razvoj staničnih linija fibroblasta PS120 s mutiranim Na+/H+ izmjenjivačem NHE3
(Development of PS120 fibroblast cell line with mutated Na+/H+ exchanger NHE3)

Autori
Martina Jolić

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet (Biološki odsjek)

Mjesto
Zagreb

Datum
27.02

Godina
2017

Stranica
88

Mentor
Mirza Žižak ; Nataša Bauer

Neposredni voditelj
Mirza Žižak

Ključne riječi
NHE3 ; CaMKII ; NHERF2

Sažetak
Cilj istraživanja je razvijanje staničnih linija fibroblasta PS120, bez i s proteinom NHERF2, transfeciranih s mutiranim izmjenjivačima Na+ i H+ izooblika 3 (NHE3). Stanice de se u kasnijim funkcionalnim studijama koristiti za istraživanje mehanizama regulacije NHE3 pomodu Ca2+/kalmodulin ovisne kinaze II (CaMK-II). Metodom usmjerene mutageneze mutirana su na sekvenci HANHE3 potencijalna fosforilacijska mjesta za CaMK-II. Sedam mutacija je provedeno na nativnoj sekvenci HANHE3 (pcDNA/TM7-HANHE3), dok se šest mutacija nalazi na krnjoj sekvenci HANHE3 (pcDNA/TM6-d24HANHE3). Krnja sekvenca HANHE3 (d24HANHE3) je mutanta iz koje je uklonjeno vezno mjesto za CaMK-II, segment dug 24 aminokiseline (Leu586-Arg609). Mutirana su slijededa fosforilacijska mjesta: Ser554, Ser562, Ser607, Ser663, Ser693, Ser694 i Ser810. U ekspresijskom vektoru pcDNA/TM7-HANHE3 mutacije su provođene uzastopno, jedna nakon druge, pri čemu su korištene slijedede metode: reakcija PCR, transformacija bakterija mutiranom HANHE3, umnožavanje bakterija u tekudem mediju, izolacija umnoženog plazmida iz bakterija i sekvenciranje. Ekspresijski vektor pcDNA/TM6-d24HANHE3 je konstruiran u dva koraka. U prvom je pomodu krnje sekvence d24HANHE3 konstruirana mutanta pcDNA/TM2-d24HANHE3 unutar koje su mutirani Ser554/Ser562 u Ala554/Ala562. U drugom koraku su najprije restrikcijskom endonukleazom PmaCI pocijepani pcDNA/TM7-HANHE3 i pcDNA/TM2-d24HANHE3 u po dva DNA isječka, duži vektorski dio i kradi umetak. Vektorski dio (f-pcDNA/TM4-HANHE3) izoliran iz pcDNA/TM7-HANHE3 sadržavao je četiri mutacije, dok umetak (fTM2-d24HANHE3) izoliran iz pcDNA/TM2-d24HANHE3 sadržavao dvije mutacije i deleciju veznog mjesta. Zatim je povezivanjem vektora i umetka pomodu ligacije konstruiran ekspresijski vektor pcDNA/TM6-d24HANHE3. Ekspresijski vektori su postupkom transfekcije unijeti u stanične linije fibroblasta PS120 bez i s proteinom NHERF2. Selekcijskim antibiotikom G418 selektirane su uspješno transfecirane stanice, a zakiseljavanjem transfeciranih staničnih linija selektirane su stanice s funkcionalnim mutiranim proteinom NHE3 na površini stanica.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Interdisciplinarne prirodne znanosti, Temeljne medicinske znanosti, Biotehnologija u biomedicini (prirodno područje, biomedicina i zdravstvo, biotehničko područje)

POVEZANOST RADA