Naslov
Uspostava metoda za izolaciju egzosoma iz plazme i njihovu karakterizaciju
(Evaluation of methods for isolation of exosomes from plasma and their characterization)

Autori
Jurič, Magdalena ; Somborac Bačura, Anita (mentorica)

Vrsta, podvrsta
Ostale vrste radova, rektorova nagrada

Godina
2022

Ključne riječi
egzosomi, izolacija, karakterizacija, kolorektalni karcinom, proteini
(exosomes, isolation, characterization, colorectal cancer, proteins)

Sažetak
Egzosomi su izvanstanične vezikule promjera 30 – 150 nm koji se formiraju u multivezikularnom tijelu, a iz stanice otpuštaju procesom egzocitoze. Molekularni sadržaj egzosoma izrazito je bogat proteinima i RNA molekulama, a moguće je pronaći i dijelove genomske DNA. Sadržaj se u egzosome doprema ciljano, posebno reguliranim mehanizmima, te on odražava pojedinosti stanica ili tkiva iz kojeg potječu što je temelj njihovog korištenja u dijagnostičke svrhe. Egzosomi podrijetlom iz tumorskih stanica sudjeluju u reprogramiranju stanica tumorskog okoliša čime stvaraju pogodnije uvijete za rast tumora, inhibiraju djelovanje stanica imunosnog sustava, potiču angiogenezu te mogu doprinijeti kemorezistenciji tumora parakrinim signaliziranjem između pojedinih tumorskih stanica. Iako važnost egzosoma postaje sve bitnija, njihova nanometarska veličina uvelike otežava njihovu izolaciju i karakterizaciju. Cilj ovoga rada bio je uspostaviti metodu za izolaciju egzosoma iz plazme bolesnika s kolorektalnim karcinomom. Plazma je dobivena centrifugiranjem pune krvi bolesnika s kolorektalnim karcinomom. Izolacija egzosoma provedena je korištenjem dva komercijalno dostupna kompleta, miRCURY Exosome Serum / Plasma Kit (Qiagen, Njemačka) i Invitrogen Total Exosome Isolation Kit (from plasma) (Thermo Fisher Scientific, SAD). Egzosomi su lizirani RIPA puferom i sonikacijom. Koncentracija proteina ispitana je kolorimetrijskom metodom s bicinkoniničnom kiselinom te mjerenjem apsorbancije na 280 nm korištenjem DS-11 spektrofotometra (DeNovix, SAD). Uzorci egzosoma pripremljeni su za SDS-PAGE miješanjem s Laemmlijevim puferom (s ili bez β- merkaptoetanola). Karakterizacija je provedena Western blot metodom uz upotrebu mišjih monoklonskih protutijela za CD9, HSC70, aktin i kalneksin (Invitrogen, SAD). Određivanjem koncentracije proteina kolorimetrijskom metodom dobivena je zadovoljavajuća preciznost u seriji (7, 91 %), točnost (96, 53 %) i linearnost (R = 0, 996), a RIPA pufer ne interferira pri mjerenju. S druge strane, rezultati određivanja proteina mjerenjem apsorbancije na 280 nm nisu bili prihvatljivi zbog nemogućnosti otklanjanja interferencije RIPA pufera. Za korištenje te metode bilo bi potrebno koristiti pufer za lizu koji ima manju apsorbanciju na valnoj duljini mjerenja. Vizualnim očitanjem udjela proteina zaostalih na gelu nakon prijenosa proteina na membranu tijekom Western blota zaključeno je da Qiagenov komplet daje bolji prinos egzosoma od Thermo Fisherovog. U svim je uzorcima egzosoma Western blot analizom dokazana prisutnost njihovog biljega CD9, uz nereducirajuće uvjete (bez β-merkaptoetanola). Odsutnost endoplazmatskog retikuluma u uzorcima dokazana je izostankom vrpce karakteristične za kalneksin. U pojedinim je uzorcima dobiven signal za HSC70, ali na području krive molekulske mase, a niti u jednom uzorku nije dokazan aktin. Metode za određivanje aktina i HSC70 stoga je potrebno dodatno optimizirati. Zaključno, ovim radom pokazano je da je za izolaciju egzosoma primjeren Qiagenov komplet, a za određivanje koncentracije proteina u uzorcima egzosoma s RIPA puferom kolorimetrijska metoda s bicinkoniničnom kiselinom. Western blot metodom dokazan je karakteristični biljeg CD9 (uz nereducirajuće uvjete) i odsustvo endoplazmatskog retikuluma u uzorcima egzosoma, što dokazuje prikladnost uzoraka egzosoma za daljnje analize RNA molekula.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Farmacija

POVEZANOST RADA