Pregled bibliografske jedinice broj: 1221041
Konstrukcija mutiranog protonskog izmjenjivača NHE3 i njegova funkcija
Konstrukcija mutiranog protonskog izmjenjivača NHE3 i njegova funkcija, 2015., diplomski rad, diplomski, Zagreb, Hrvatska
CROSBI ID: 1221041 Za ispravke kontaktirajte CROSBI podršku putem web obrasca
Naslov
Konstrukcija mutiranog protonskog izmjenjivača NHE3
i njegova funkcija
(Construction of the mutated NHE3 proton exchanger
and his function)
Autori
Brauneger, Dora
Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski
Mjesto
Zagreb, Hrvatska
Datum
27.02
Godina
2015
Stranica
82
Mentor
Bauer, Nataša
Ključne riječi
NHE3, kloniranje
(NHE3, cloning)
Sažetak
Tema ovog rada bila je stvoriti mutirani transmembranski protein izmjenjivač Na+/H+ izoforme 3 (NHE3) iz kojeg sam postupkom delecije uklonila 24 aminokiseline (Leu 586 – Arg609) važne za vezanje pojedinih stimulatora i inhibitora aktivnosti proteina NHE3 koji sudjeluje u održavanju homeostaze pH stanica. Deleciju sam provela pomoću lančane reakcije polimerazom (PCR) metodom preklapanja dvaju fragmenta DNA sekvence NHE3 svojim preklopnim nastavcima. Predložak mi je bio plazmid pcDNA 3.1(+) s prethodno ugrađenom genskom sekvencom NHE3 (pcDNA/NHE3). Uspješnost delecija sam provjerila usporedbom dobivenog mutiranog fragmenta AD s kontrolnim fragmentom bez delecije. Fragment AD i plazmid pcDNA/NHE3 sam potom tretirala restrikcijskim enzimom PmaCI koji ima dva restrikcijska mjesta unutar sekvence NHE3. Tretirani plazmid pcDNA/NHE3 i fragment Ad sam potom tretirala enzimom ligaza i kao rezultat dobila plazmid s mutiranom sekvencom NHE3, pcDNA/dNHE3. Produkt ligacije sam transformacijom ubacila u bakterijske stanice Escherichia coli soja DH5α. Iz izraslih kolonija sam izolirala plazmid pcDNA/dNHE3 i pomoću restrikcijskih enzima HindIII i KpnI dokazala uspješnost ligacije i pravilnu orijentaciju ubačenog fragmenta AD. PCR reakcijom sam dokazala uspješnost mutacije koristeći negativnu početnicu koja se veže za izbačeni aminokiselinski slijed. Konačna potvrda postojanja delecije je bilo slanje dobivenog plazmida na sekvenciranje. Plazmid pcDNA/dNHE3 sam na kraju transfecirala u staničnu liniju fibroblasta PS120 i postupkom zakiseljavanja dokazala funkcionalnost proteina NHE3 unatoč mutaciji što bi značilo da unutar sekvence NHE3 postoji više regulacijskih mjesta koji reguliraju aktivnost proteina NHE3, zasebno ili u interakciji.
Izvorni jezik
Hrvatski
