Naslov
Konstrukcija vektora za istovremenu ekspresiju teškog i lakog lanca imunoglobulina G u staničnoj liniji HEK293 Freestyle
(Constructionof a vector for simultaneous expression of immunoglobin G heavy and light chain in HEK293 Freestyle cell line)

Autori
Bošković, Maria

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
05.10

Godina
2017

Stranica
49

Mentor
Vojta, Aleksandar

Neposredni voditelj
Tadić, Vanja

Ključne riječi
imunoglobulin G (IgG) ; teški i laki lanac ; glikozilacija ; T2A peptid ; HEK293 Freestyle ; ekspresija
(immunoglobulin G (IgG) ; heavy and light chain ; glycosylation ; T2A peptide ; HEK293 Freestyle ; expression)

Sažetak
Imunoglobulin G (IgG) se sastoji od lakog i teškog lanca. Njihova posttranslacijska obrada uključuje N-glikozilaciju na Fc dijelu. Glikozilacija ima važnu ulogu u modulaciji efektorske funkcije IgG- a. Za ispitivanje glikozilacijskog profila IgG-a te za njegovu manipulaciju (glikoinženjerstvo) koristi se model stanične linije HEK 293 Freestyle. Te stanice rastu u suspenziji, lako se transfeciraju i izlučuju IgG u medij ako su u njih ubačeni vektori za ekspresiju teškog i lakog lanca IgG-a. Ovaj model omogućava istraživanje glikozilacije IgG-a kotransfekcijom vektora za ekspresiju lanaca IgG-a i molekularnih alata koji utječu na regulaciju glikozilacije, kao što su aktivatori ili represori transkripcije bazirani na CRISPR- Cas9 sustavu. Cilj ovog istraživanja je metodama genetičkog inženjerstva konstruirati vektore za istovremenu ekspresiju teškog i lakog lanca IgG-a primjenom dva različita pristupa dizajnu ekspresijskog vektora. Prvi pristup temelji se na bicistronskoj ekspresiji teškog i lakog lanca IgG-a povezanih samocijepajućim peptidom T2A, dok će drugi konstrukt sadržavati dvije ekspresijske kazete (za teški i laki lanac) pod zasebnim promotorima. Nakon transfekcije HEK293 Freestyle stanica konstrukti će se usporediti dot blot metodom s obzirom na količinu izlučenog IgG-a. Uspješno su dobiveni konstrukti sa samocijepajućim peptidom T2A , koji je ubačen u bakterijski soj E. coli XL10- Gold u svrhu kloniranja plazmidnih konstrukata. Plazmidni konstrukti uspješno su transfecirali staničnu liniju HEK293 Freestyle. Stanični supernatant je skupljen treći i peti dan te je semikvantitativno uspoređena količina izlučenog IgG-a pomoću metode dot blot. Konstukti s dvije ekspresijske kazete (za teški i laki lanac) pod zasebnim promotorima nije dobiven. Mogući razlog je velika zastupljenost ponavljajućih sljedova zbog čega je bila povećana učestalost rekombinacije u E. coli XL10-Gold.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biologija

POVEZANOST RADA