Naslov
Dozrijevanje, oplodnja i uzgoj oplođenih goveđih jajnih stanica in vitro
(Maturation, fertilization and culture of fertilized bovine oocytes in vitro)

Autori
Getz, Iva

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, magistarski rad

Fakultet
Veterinarski fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
14.07

Godina
1999

Stranica
86

Mentor
Makek, Zdenko

Neposredni voditelj
Matković, Mario

Ključne riječi
krava; folikul; jajna stanica; oplodnja in vitro; uzgoj in vitro; kokultura; zametak
(cow; follicle; oocyte; fertilization in vitro; culture in vitro; coculture; embryo)

Sažetak
Razvoj biotehnoloških metoda tijekom posljednjeg desetljeća otvorio je nove mogućnosti i pomaknuo granice selekcije u uzgoju i rasplođivanju domaćih životinja. Primjena MOET-a omogućila je brži intenzitet selekcije i skraćenje generacijskog intervala te tako povećala utjecaj genoma majki u uzgoju stoke. Proizvodnja goveđih zametaka in vitro (IVP) nalazi se na prijelazu iz strogo znanstvenih istraživanja u jednu modernu tehnologiju koja dopušta donošenje uzgojnih planova i tehnika proizvodnje koje uključuju i druge biotehnološke metode kao što su bližnjenje, kloniranje, transgenezu, određivanje spola zametaka i dr. Potaknuti mogućnostima koje pružaju ove nove biotehnološke metode proveli smo, prvi put u Republici Hrvatskoj, istraživanje postupaka dozrijevanja, oplodnje i uzgoja oplođenih goveđih jajnih stanica in vitro, s krajnjom svrhom uvođenja ovih posupaka u našu veterinarsku medicinu. U svrhu istraživanja metoda in vitro dozrijevanja i oplodnje aspirirali smo ukupno 1689 folikula promjera do 8 mm iz 19 parova jajnika negravidnih krava i 46 parova jajnika junica nepoznate reprodukcijske anamneze, sakupljenih na liniji klanja. Na temelju morfološke ocjene parove jajnika svrstali smo u faze spolnog ciklusa. Folikule smo svrstali u dva razreda, na osnovi površinskog promjera: do 3 mm i od 3 do 8 mm. Pregledom aspirata folikula pronašli smo ukupno 734 jajne stanice: 317 u razredu folikula promjera do 3 mm te 417 u razredu folikula promjera od 3 do 8 mm. Uspjeh aspiracije foliikula iznosio je 43,46%. Nezrele goveđe jajne stanice morfološki smo ocjenili i svrstali u tri kategorije. U postupak dozrijevanja in vitro uzeli smo samo nezrele jajne stanice prve i druge kategorije, razvrstane po fazama spolnog ciklusa i po razredima folikula iz kojih su aspirirane. Za dozrijevanje goveđih jajnih stanica in vitro koristili smo medij TCM 199 (Gibco, Life technologies, cat.no. 21200) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS) i obogaćen gonadotropinima (Pergonal( 75/75 i.j. FSH/LH, Serono). Nakon 24 do 26 sati inkubacije na 39°C uz 5% CO2 u zraku i 80% vlage, ocijenili smo uspjeh dozrijevanja in vitro, na osnovu ekspanzije stanica kumulusa i korone. Od 487 nezrelih jajnih stanica u IVM postupku uspješno je dozrelo 448, odnosno 91,99%. Od 262 jajnih stanica svrstanih u I kategoriju, dozrelo je 262 (95,04%), a od 225 jajne stanice II kategorije dozrelo je 199 (88,44%). Statističkom obradom podataka utvrđena je visoko signifikantna razlika (p(0,001) u sposobnosti dozrijevanja između nezrelih goveđih jajnih prve, odnosno druge kategorije. U postupak oplodnje in vitro uzeli smo 278 goveđih jajnih stanica dozrelih in vitro. Duboko smrznutu i odmrznutu spermu bika pripremili smo za IVF swim-up posuptkom ili centrifugiranjem na gradijentu Percolla. Tretiranjem sperme swim-up metodom dobili smo 50%-tnu progresivnu pokretljivost i koncentraciju spermija od 22 x 106/ml, a nakon 48 sati ko-inkubacije jajnih stanica i spermija samo 4,6% oplođenih jajnih stanica. Nasuprot tome, nakon pripreme sperme na gradijentu Percolla postigli smo progresivnu pokretljivost spermija u sedimentu oko 65% i koncentraciju 35 x 106/ml, a u IVF postupku dobili smo 50% oplođenih goveđih jajnih stanica. Goveđe zametake dobivene IVM/IVF postupkom uzgajali smo in vitro do stadija morule i blastociste u TCM 199 mediju s 10% FCS-a, u ko-kulturi sa stanicama granuloze. Ovom metodom uzgoja od 85 oplođenih jajnih stanica dobili smo 7. dana nakon oplodnje 11 morula i 1 blastocistu, odnosno 14,1% goveđih zametaka koji su međutim po morfološkim kriterijima bili slabije kvalitete. Možemo zaključiti da je ovim istraživanjem postavljen temeljni protokol za IVP goveđih zametaka i dobiven prvi goveđi zametak nakon kompletnog postupka dozrijevanja, oplodnje i uzgoja in vitro. Dobiveni rezultati ukazuju na potrebu daljnjeg usavršavanja metoda za oplodnju i uzgoj goveđih zametaka in vitro, kako bi dobili više kvalitetnih blastocista prikladnih za embriotransfer ili duboko smrzavanje.

Izvorni jezik
Hrvatski

POVEZANOST RADA