Pregled bibliografske jedinice broj: 530553
Utjecaj mutacija metil-transferaze NpmA na vezanje kofaktora S-adenozil-metionina i ostvarivanje bakterijske otpornosti na aminoglikozidne antibiotike
Utjecaj mutacija metil-transferaze NpmA na vezanje kofaktora S-adenozil-metionina i ostvarivanje bakterijske otpornosti na aminoglikozidne antibiotike, 2011., diplomski rad, diplomski, Farmaceutsko-biokemijski fakultet, Zagreb
CROSBI ID: 530553 Za ispravke kontaktirajte CROSBI podršku putem web obrasca
Naslov
Utjecaj mutacija metil-transferaze NpmA na vezanje kofaktora S-adenozil-metionina i ostvarivanje bakterijske otpornosti na aminoglikozidne antibiotike
(The effect of NpmA methyltransferase mutations on cofactor binding and resistance to aminoglycoside antibiotics)
Autori
Kukolj, Eva
Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, diplomski rad, diplomski
Fakultet
Farmaceutsko-biokemijski fakultet
Mjesto
Zagreb
Datum
11.07
Godina
2011
Stranica
66
Mentor
Maravić Vlahoviček, Gordana
Ključne riječi
Aminoglikozidni antibiotici; otpornost; metil-transferaza NpmA; mutacija
(Aminoglycoside antibiotics; resistance; methyltransferase NpmA; mutation)
Sažetak
Široka upotreba aminoglikozidnih antibiotika dovela je do otpornosti bakterija na njihovo djelovanje. Jedan od mehanizama otpornosti je metilacija specifičnih baza u 16S rRNA, čime se onemogućava vezanje aminoglikozida, a odvija se putem 16S rRNA metil-transferaza. Poznata su dva mjesta djelovanja takvih enzima: N7 gvanina na položaju 1405 i N1 adenina na položaju 1408. NpmA prva je m1A 16S rRNA metil-transferaza izolirana iz patogenog soja Escherichia coli ARS3 koja metilira adenin na položaju 1408 te pruža otpornost na široki spektar aminoglikozidnih antibiotika. Na temelju usporedbe sa srodnim enzimima iz porodice Kam pretpostavljeno je da bi evolucijski očuvane aminokiseline D30, D55, E88, T109 i S195 mogle sudjelovati u vezanju kofaktora S-adenozil-metionina. Cilj rada bio je odrediti kako supstitucija kodona za navedene aminokiselina kodonom za alanin utječe na aktivnost metil-transferaze NpmA i ostvarivanje bakterijske otpornosti na aminoglikozidne antibiotike. Divlji tip i mutirane varijante gena za metil-transferazu NpmA prethodno su u laboratoriju klonirani u ekspresijski vektor pET-25b(+). Proteini su eksprimirani u soju E. coli BL21(DE3)pLysS uz dodatak IPTG. Pročišćavanjem bakterijskog lizata na koloni Ni-NTA agaroze dobiveni su čisti mutirani proteini za ispitivanje enzimske aktivnosti. Čistoća proteina provjerena je denaturirajućom elektroforezom u poliakrilamidnom gelu. Metilacijskim testom utvrĎena je aktivnost mutanata in vitro, dok je u pokusima in vivo ispitana sposobnost ostvarivanja otpornosti u stanicama E. coli, koja je prirodno osjetljiva na kanamicin. Rezultati pokazuju aminokiselina D30 ima važnu ulogu za aktivnost metil-transferaze NpmA jer se njenom mutacijom značajno smanjuje razina metilacije ribosoma i minimalna inhibitorna koncentracija kanamicina. Usporedbom dobivenih rezultata sa strukturnim predviĎanjima, zaključuje se da mutacija aspartata na položaju 30 onemogućava stvaranje interakcija izmeĎu enzima i kofaktora. Mutacija aminokiseline D55 u manjoj mjeri utječe na aktivnost enzima NpmA, što znači da D55 nema ključnu ulogu u ostvarivanju interakcija sa supstratom. Mutirane varijante enzima E88A, T109A i S195A nisu pokazale značajnu razliku u odnosu na divlji tip u svim in vivo i in vitro testovima aktivnosti, što znači da ne ostvaruju ključne interakcije s kofaktorom, odnosno supstratom. Dobiveni rezultati i poznate strukturne karakteristike metil-transferaze NpmA temelj su za daljnja istraživanja mehanizma djelovanja NpmA nužna za prepoznavanje i oblikovanje inhibitora koji bi spriječio bakterijsku otpornost prema aminoglikozidnim antibioticima.
Izvorni jezik
Hrvatski
Znanstvena područja
Biologija, Farmacija
POVEZANOST RADA
Projekti:
006-0982913-1219 - Molekularne osnove djelovanja antibiotika i mehanizmi bakterijske rezistencije (Maravić Vlahoviček, Gordana, MZOS ) ( CroRIS)
Ustanove:
Farmaceutsko-biokemijski fakultet, Zagreb
Profili:
Gordana Maravić Vlahoviček
(mentor)