ࡱ> *,%&'()iG bjbjَ !8j]T2222N2 + 7.BBA$de?i??ea  aaa?؂  22?aa+fpD  7;22J#IDZavod za mikrobiologiju i zarazne bolesti Veterinarskog fakulteta Sveu iliata u Zagrebu Zagreb, 7. sije nja 1999. Predmet: Ocjena pristupnika Miroslava Benia i teme magistarskog rada F A K U L T E T S K O V I J E  E Veterinarskog fakulteta u Zagrebu U svojoj sjednici od 26. studenog 1998. Vijee ovog fakulteta izabralo je povjerenstvo u sastavu: prof. dr. sc. T. Nagli, dr. sc. S. Topolko i prof. dr. sc. M. Had~iosmanovi za ocjenu pristupnika Miroslava Benia, dipl. veterinara, i teme njegovog znanstvenog magistarskog rada pod naslovom: "NALAZI BAKTERIJA U SKUPNIM UZORCIMA MLIJEKA KOZA I OVACA PODRIJETLOM IZ OBITELJSKIH GOSPODARSTAVA". U vezi s tim podnosimo Naslovu ovo I Z V J E ` E Miroslav Beni, dipl. veterinar, roen je 26. srpnja 1967. u Davoru. Na Veterinarskom fakultetu u Zagrebu diplomirao je 1994. s prosje nom ocjenom 3.76. Zaposlen je kao znanstveni novak u Hrvatskom veterinarskom institutu u Zagrebu. Znanstveni poslijediplomski studij smjera "Mikrobiologija i epizootiologija" upisao je u Zavodu za mikrobiologiju i zarazne bolesti domaih ~ivotinja ak. god. 1996/97. Dosad je objavio 3 stru na rada. U sklopu izrade magistarskog rada pristupnik predla~e istra~ivanja bakterioloake kakvoe kozjeg i ov jeg mlijeka, mikrobioloakim i seroloakim pretragama skupnih uzorka uzetim na pojedinim otkupnim mjestima u Hrvatskoj. Posebnu pozornost pristupnik e pridati utvrivanju kontaminacije bakterijama koje uzrokuju intoksikacije hranom. Uz bakterije iz te skupine kojima se redovito pridaje va~nost, pristupnik e posebno nastojati dokazati ili isklju iti kontaminacije listerijama, salmonelama i enterohemoragi nim serovarom bakterije Escherichia coli O157:H7. Te su bakterije u nekim zemljama ustanovljene u zna ajnom broju uzoraka sirovog mlijeka malih pre~iva a, a u suvremenoj higijeni mlijeka pridaje im se osobita va~nost s obzirom na patogenost za ljude. U Hrvatskoj do sada nisu provedena sustavna istra~ivanja bakterijske kontaminacije skupnih uzoraka kozjeg i ov jeg mlijeka na otkupnim mjestima, a o nalazima listerija, salmonela i E. coli O157:H7 u mlijeku tih ~ivotinja nema podataka. Dodatna vrijednost predlo~enih istra~ivanja je u uporabi suvremenih seroloakih testova (imunoenzimnih testova) i usporedbi njihove pouzdanosti s obzirom na klasi ne mikrobioloake postupke. Na osnovi iznijetog dr~imo da su predlo~ena istra~ivanja utemeljena u znanstvenom smislu, a istodobno imaju prakti no zna enje. Stoga predla~emo naslovu da Miroslavu Beniu, dipl. vet., odobri izradu magistarskog rada pod naslovom: "NALAZI BAKTERIJA U SKUPNIM UZORCIMA MLIJEKA KOZA I OVACA PODRIJETLOM IZ OBITELJSKIH GOSPODARSTAVA", a za mentore izabere prof. dr. sc. Tomu Naglia i Dr. sc. Stjepana Topolka, znanstvenog savjetnika u Hrvatskom veterinarskom institutu u Zagrebu. Povjerenstvo 1. Prof. dr. sc. Tomo Nagli 2. Dr. sc. Stjepan Topolko 3. Prof. dr. sc. Mirza Had~iosmanovi SADR}AJ I. UVOD II. SVRHA RADA III. MATERIJAL I METODE III.1. Podrijetlo uzoraka III.2. Hranjive podloge III.3. Provedene pretrage III.3.1. Odreivanje ukupnog broja bakterija III.3.2. Utvrivanje nazo nosti patogenih i saprofitskih bakterija III.3.3. Imunoenzimni test za dokazivanje Listeria spp. (TECRA LISTERIA VISUAL IMMUNOASSAY, NOACK) III.3.3.1. Predobogaivanje uzoraka III.3.3.2. Na ela testa III.3.3.3. Potrebni sastojci za provedbu testa: III.3.3.3.1. Sastojci kita III.3.3.3.2. Ostali materijal potreban za izvoenje testa: III.3.3.4. Priprema sastojaka za uporabu III.3.3.5. Izvoenje testa: III.3.4. Imunoenzimni test za dokazivanje bakterije E. coli O157 (TECRA E. COLI O157 VISUAL IMMUNOASSAY, NOACK) III.3.4.1. Predobogaivanje uzoraka III.3.4.2. Izvoenje testa III.3.5. Dopunsko provjeravanje pozitivnih uzoraka pomou GLISA Singlepath E. coli III.3.5.1. Na ela testa III.3.5.2. Provedba testa: III.3.5.3. Tuma enje rezultata: III.3.6. Imunoenzimni test za dokazivanje Salmonella spp. (TECRA SALMONELLA VISUAL IMMUNOASSAY, NOACK) III.3.6.1. Obogaivanje uzoraka III.3.6.2. Izvoenje testa III.3.7. Koagulaza test III.3.8. CAMP test III.4. Istra~ivanje osjetljivosti imunoenzimnih testova za salmonele i listerije III.4.1. Istra~ivanje osjetljivost imunoenzimnog testa TECRA Salmonella VIA III.4.2. Istra~ivanje osjetljivosti imunoenzimnog testa TECRA Listeria VIA IV. PODACI IZ LITERATURE IV.1. Openito o higijenskoj kakvoi sirovog mlijeka IV.2. Openito o rodu Listeria IV.2.1. Listerioza u ~ivotinja IV.2.2. Listerioza u ljudi IV.2.3. Na ini kontaminacije mlijeka listerijama IV.3. Openito o bakteriji E. coli, serovar O157:H7 IV.3.1. Bolest u ljudi uzrokovana serovarom O157:H7 IV.4. Bakterije roda Salmonella u sirovom mlijeku IV.4.1. Openito o salmonelama IV.4.2. Salmoneloza u ~ivotinja IV.4.3. Salmoneloza u ljudi V. REZULTATI V.1. Higijenska kakvoa mlijeka V.1.1. Ukupni broj bakterija u pretra~enim uzorcima sirovog mlijeka V.1.2. Nalazi bakterija u pretra~enim skupnim uzorcima kozjeg i ov jeg mlijeka V.2. Rezultati imunoenzimnih pretraga sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka V.3. Osjetljivost imunoenzimnih testova VI. RASPRAVA VI.1. Higijenska kakvoa mlijeka VI.1.1. Ukupni broj bakterija VI.1.2. Zastupljenost pojedinih rodova bakterija u pretra~enim uzorcima mlijeka VI.1.3. U estalost listerija u pretra~enim uzorcima sirovog mlijeka VI.1.4. Bakterija E. coli O157:H7 u sirovom mlijeku VI.1.5. Salmonele u sirovom mlijeku VI.2. Osjetljivost imunoenzimnih testova za salmonele i listerije VI.2.1. Osjetljivost testa TECRA Salmonella VIA VI.2.2. Osjetljivost testa TECRA Listeria VIA VII. ZAKLJU CI: VIII. LITERATURA IX. SA}ETAK VETERINARSKI FAKULTET SVEU ILI`TA U ZAGREBU Miroslav Beni NALAZI BAKTERIJA U SKUPNIM UZORCIMA MLIJEKA KOZA I OVACA PODRIJETLOM IZ OBITELJSKIH GOSPODARSTAVA Magistarski rad Zagreb, 1999. UVOD Mlijeko je visokovrijedna namirnica ~ivotinjskog podrijetla koja sadr~ava gotovo sve hranjive tvari potrebne za ~ivot. Pojedini autori isti u ljekovita svojstva mlijeka, naro ito kozjeg. Kao namirnica kompleksnog kemijskog sastava, mlijeko predstavlja vrlo dobru hranjivu podlogu za veliki broj bakterija i drugih mikroorganizama koji mogu uzrokovati upalu mlije ne ~lijezde i infekcije ili trovanja ljudi, te kvarenje mlijeka i mlije nih proizvoda. Ti mikroorganizmi mogu dospijeti u mlijeko ve u samoj mlije noj ~lijezdi ili se njima mlijeko one isti u tijeku mu~nje i transporta. Pod pojmom higijenske kakvoe mlijeka podrazumijeva se sadr~aj somatskih stanica i ukupnog broja bakterija u 1 mL mlijeka, te nazo nost patogenih bakterija (koagulaza-pozitivnih stafilokoka, salmonela, proteusa i sulfitoreducirajuih klostridija u mlijeku. U posljednjih desetak godina posebno se isti e va~nost provjere prisutnosti bakterijskih vrsta u mlijeku povezanih s trovanjima hranom. To se prije svega odnosi na pripadnike rodova Salmonella, Clostridium, Bacillus, Shigella, Campylobacter, Yersinia, Staphylococcus, Listeria. A u tu se skupinu mo~e ubrojiti i enterohemoragi ni serovar E. coli O157:H7. U veini europskih zemalja ukupni broj bakterija u 1 mL mlijeka jedan je od pokazatelja njegove kakvoe, va~an pri odreivanju cijene. Na temelju broja bakterija, mlijeko se prema kakvoi razvrstava u razrede. U posljednje se vrijeme i u naaoj zemlji ula~u napori da se donese Pravilnik kojim bi se pri formiranju otkupne cijene sirovog mlijeka uzeli u obzir kemijski (mlije na mast, bjelan evine, suha tvar) i higijenski pokazatelji (broj somatskih stanica i ukupni broj bakterija). Prema dosadaanjem Pravilniku higijenski je bilo prihvatljivo sirovo mlijeko koje je sadr~avalo najviae 3 x 106 bakterija u 1 mL. Treba istai da su pravilnici europskih zemalja u tom smislu daleko stro~i. Prema normativima Europske unije, higijenski prihvatljivim smatra se mlijeko koje sadr~i najviae 100.000 bakterija u 1 mL. Iako veliki broj bakterija ne zna i i da su one patogene, kao ato ni mali broj bakterija ne zna i da ne mogu djelovati atetno, openito je prihvaeno mialjenje da mlijeko s velikim brojem bakterija potje e iz oboljelog vimena, ili da u tijeku mu~nje i rukovanja nisu poativana pravila higijene i da mlijeko nije bilo rashlaeno. U smislu javnog zdravstva smatra se da veliki broj bakterija predstavlja veu opasnost za ljude. Ova postavka joa viae dobiva na va~nosti uzme li se u obzir da dio pu anstva u~iva sirovu hranu, uklju ujui i mlijeko. Pored toga, neke se vrste sireva proizvode od sirovog mlijeka bez prethodne pasterizacije. Higijenska kakvoa gotovog proizvoda, pored niza drugih imbenika, izravno ovisi o kakvoi upotrijebljene sirovine (Cosentino i Palmas, 1997). Prema podacima iz strane literature, sirovo mlijeko i prozvodi od sirovog mlijeka esti su izvor infekcija i bolesti u ljudi. U ovom radu posebnu pozornost pridali smo nazo nosti bakterija u pretra~ivanim uzorcima mlijeka, koje uzrokuju infekcije i intoksikacije hranom, poglavito listerija, salmonela i serovara E. coli O157:H7. II. SVRHA RADA Svrha je ovog rada bila da se objektivnim mikrobioloakim postupcima odredi bakterioloaka kakvoa sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka iz obiteljskih gospodarstava. Pored toga, cilj je naaeg istra~ivanja bio da ustanovimo prikladnost suvremenih komercijalno dostupnih imunoenzimnih testova za utvrivanje prisutnosti bakterija iz rodova Listeria i Salmonella te vrste E. coli serovar O157:H7 u kozjem i ov jem mlijeku i opravdanost njihove uporabe u odreivanju mikrobioloake kakvoe tih namirnica. II. PREGLED LITERATURE II. 1. Opi podaci o higijenskoj kakvoi sirovog mlijeka Proizvodnja kozjeg i ov jeg mlijeka zauzima tree, odnosno etvrto mjesto u sveukupnoj svjetskoj proizvodnji mlijeka. Dok o kakvoi i higijenskim osobinama kravljeg mlijeka postoje strogi pravilnici, standardi za kozje i ov je mlijeko puno su bla~i. Poteakoe u osiguranju higijenske kakvoe kozjeg i ov jeg mlijeka proizlaze iz specifi nosti njihove proizvodnje, koja je razmjerno mala po ~ivotinji. Dijelom su posljedica na ina ru ne ili strojne mu~nje, zoohigijenskih uvjeta dr~anja tih ~ivotinja i nepovoljnih klimatskih uvjete dr~anja (Klinger i Rosenthal, 1997). Svje~e kozje mlijeko koristi se u prehrani djece i osoba alergi nih na kravlje mlijeko. Pored toga, upotrebljava se i za proizvodnju sireva. Visok postotak mlije ne masti i svojstven okus ov jeg sira ine ga vrlo tra~enim proizvodom na tr~iatu. Kakvou mlijeka odreuju sastav i higijensko stanje. Zahtjevi za kakvoom sirovog mlijeka su dvojaki, i odnose se na zaatitu zdravlja ljudi koji koriste mlijeko i na optimalna prehrambena svojstva tog mlijeka (Heeschen, 1998). Mlijeko visoke kakvoe odlikuje se sljedeim svojstvima: sadr~i mali broj saprofitskih mikroorganizama ne sadr~i patogene mikroorganizme, uklju ujui uzro nike mastitisa ne sadr~i ostatke atetnih tvari , ili ih sadr~ava ispod maksimalno dopuatene granice (prema engl. maximum residue limit  MRL) 4. Va~an pokazatelj zdravlja vimena i higijenske kakvoe mlijeka je sadr~aj somatskih stanica. Kao gornju granicu broja somatskih stanica za kravlje mlijeko Europska unija prihvatila je vrijednost od 400.000/mL (Heeschen, 1998). Meutim, o dopuatenom broju somatskih stanica u kozjem mlijeku joa uvijek se u znanstvenim i stru nim krugovima raspravlja. Veina autora smatra da se broj somatskih stanica u mlijeku zdravih koza kree u rasponu od 360.000 pa do viae od 1 milijun u mililitri mlijeka (Poutrell i Lerondelle, 1983.; Wilson i sur. 1995). Apokrini tip sekrecije mlijeka u mlije noj ~lijezdi koze odgovoran je za poveani broj somatskih stanica, jer se pri ovom na inu sekrecije u mlijeko izlu uju i citoplazmatske estice (Dulin i sur., 1983; Park i Humphrey, 1986.). Antunac i sur. (1997) dr~e da bi kao gornju granicu broja somatskih stanica u kozjem mlijeku trebalo uzeti vrijednost od 1 x 106/mL. Ubikvitarna bakterijska flora mlijeka mo~e se podijeliti u nekoliko podskupina (Heeschen, 1998), s obzirom na kemijske sastojke koje razgrauje: glikoliti ke bakterije (npr.streptokoki i laktobacili) proteoliti ke bakterije (Pseudomonas, Enterobacteriaceae, aerobne sporotvorne bakterije) Lipoliti ne bakterije (Pseudomonas, mikrokoki, Corynebacterium) Nazo nost veeg broja ubikvitarnih bakterija u sirovom mlijeku mo~e promijeniti kemijski sastav mlijeka, a utje e i na kakvou proizvoda. Bakterijski enzimi otporni na toplinu nastavljaju djelovati i u gotovom proizvodu, poglavito ako je du~e uskladiaten, te pogoraavaju trajnost proizvoda, osobito vrhnja i pasteriziranog mlijeka (Heeschen, 1998). Pod pojmom patogene bakterije podrazumijevaju se posvuda rasprostranjene vrste, tzv.  klasi ne patogene bakterije (Heeschen, 1998), te vrste koje se rjee pojavljuju u sirovom mlijeku, a mogu uzrokovati bolest u ljudi. To se prije svega odnosi na pripadnike rodova Salmonella, Clostridium, Bacillus, Shigella, Campylobacter, Yersinia, Staphylococcus, Listeria, te vrstu E. coli serovar O 157:H 7. Prema podacima iz strane literature, sirovo mlijeko i proizvodi od sirovoga mlijeka razmjerno su esto izvorom infekcije ili intoksikacije ljudi. Za pojavu bolesti u ljudi veinom je odgovorna neprikladna temperatura pasterizacije, dodavanje sirovoga mlijeka u tehnoloakom procesu, ili zagaenje mlijeka patogenim mikroorganizmima u tijeku uskladiatenja (Klinger i Rosenthal, 1997). II.2. Opi podaci o bakterijama roda Listeria Rod Listeria obuhvaa sedam bakterijskih vrsta, to su vrste L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. ivanovii, L. welshimeri, L. grayi i L. murrayi. Posljednje dvije vrste ne smatraju se patogenim za ovjeka. U zdravstvenom smislu najva~nijom vrstom smatra se L. monocytogenes. Prvi put je izdvojena 1926. godine. Do sada je ustanovljena u riba, na bilju, u pitkoj, rije noj i otpadnoj vodi, divljim ~ivotinjama, kukcima, hrani i okoliau u kojem se hrana proizvodi. L. monocytogenes je bakterija oblika kratkih atapia, sa zaokru~enim krajevima. Bakterijske stanice pokatkad su blago savijene. Pojavljuju se pojedina no, u kraim nizovima, palisadama ili u obliku slova V i Y. Pkatkad se u razmascima tkiva nalazi u kokoidnom obliku. Promjer bakterijskih stanica iznosi 0,4-0,5 m, a du~ina 0,5-2,0 m. Postupkom prema Gramu oboji se gram-pozitivno. L. monocytogenes je gibljiva, s peritrihim bi evima, ukoliko raste pri temperaturi 20-25 C (Anon., 1994). Pri viaoj temperaturi rasta, gibljivost je slabije izra~ena. Pripadnici roda Listeria isti u se otpornoau prema niskoj i visokoj temperaturi; mogu se razmno~avati u rasponu temperature 1-45 0C. (Anon., 1996). Pored toga, L. monocytogenes mo~e pre~ivjeti proces proizvodnje i zrenja sireva proizvedenih od sirovog mlijeka, ato je potvreno u brojnim pokusima (Bachmann i Spahr, 1995). Tablica 4. Fizioloake osobine vrsta iz roda Listeria ( ) Vrstaeta-hemo-lizaCAMP* test S.aureus R.equi Tvorba kiseline izRedukcija nitrata12345L.monocytogenes + +-+++---L. innocua - --++V---L.ivanovii ++ -++--+--L.seeligeri(+)(+)-+V-+--L.welshimeri - --++V+--L. grayi - --+NT--+-L.murrayi - --+NTV-++* CAMP-test proveden s vrstama S. aureus i Rhodococcus equi; 1-glukoza; 2--metil D-manozid; 3-ramnoza; 4-ksiloza; 5-manitol; V- razli iti sojevi razli ito reagiraju; NT- nije testirano II.2.1. Listerioza u ~ivotinja Bolest listerioza se u ~ivotinja javlja se u viae oblika: - kao primarna infekcija maternice s posljedi nim poba ajem, porodom mrtvog mladun eta, ili naknadnim uginuem mladun eta. Ovaj oblik javlja se u ovaca i krava. - kao septikemija, koja se naj eae mo~e ustanoviti u janjadi i teladi; - kao listerijski encefalitis. Taj se oblik naj eae javlja u pre~iva a (ovaca, koza i goveda - kao mastitis krava, oblik listerioze koji se rijetko javlja, iako su listerije proairene u okoliau tih ~ivotinja (Pearson i Marth, 1990). II.2.2. Listerioza u ljudi Premda su ljudi veinom vrlo izlo~eni infekciji listerijama, posebice pri u~ivanju sirove hrane, razmjerno rijetko obole. Meutim, u rizi noj skupini letalitet mo~e iznositi 20-30 %. Oboljevanju su najpodlo~nije osobe oslabljene imunosti, trudnice i osobe iznad 65 godina starosti. Meu bakterijskim meningitisa u novoroen adi listerioza se po u estalosti nalazi na treem mjestu (Anon. 1996). Sirovo mlijeko i sirevi naj eai su izvori zaraze za ovjeka (Anon., 1996). Najizra~eniji klini ki znaci listerioze u ljudi su groznica i poviaena tjelesna temperatura, koji se javljaju 24-48 sati nakon infekcije (Anon., 1996). Gray i Killinger (1966) te Schwarzkopf (1996) opisali su itav niz patoloakih stanja povezanih s infekcijom vrstom L. monocytogenes: meningoencefalitis, septikemiju, prerano roenje u djece, septikemiju pri poba ajima trudnica, infekciozni sindrom, septikemiju odraslih, upalu plua, endokarditis, lokalizirane apscese, rane na ko~i, konjuktivitis, poba aj, mentalnu zaostalost i psihoti ne promjene u odraslih. O pojavi listerioze u ljudi povezane s u~ivanjem mlijeka i mlije nih proizvoda napisana su brojna izvjeaa. Tako Allerberger i Guggenbichler (1989) izvjeauju o pojavi listerioze povezane s u~ivanjem sirovog mlijeka u Austriji. Fleming i sur. (1985) opisali su pojavu listerioze u dr~avi ameri koj dr~avi Massachusetts, u tijek koje je oboljelo 49 osoba. Izvor zaraze bilo je pasterizirano mlijeko. Hayes i sur. (1986) su tijekom jedne epidemije listerioze ustanovili da 15% uzoraka sirovog mlijeka sadr~ava bakteriju L. monocytogenes. IV.2.3. Na ini one iaenja mlijeka listerijama Mlijeko se mo~e zagaditi listerijama na viae na ina: - iz bolesnog vimena. Ovo je dosta rijetka pojava. Prema podacima Jensena i sur. (1996) u tijeku 23-godianjeg istra~ivanja, mastitis krava uzrokovan bakterijom L. monocytogenes dokazan je u 0,1-0,01 %, prosje no u 0,04% krava. - krmivima zagaenim listerijama. To se poglavito odnosi na loae pripremljenu sila~u (Gray, 1960; Sanaa i sur. 1993). - zagaenim priborom za mu~nju; - izmetom ~ivotinja. Namee se zaklju ak da je zara~avanje sirovog mlijeka listerijama naj eae posljedica zagaenja iz okoliaa ~ivotinje, a puno rjee potje e iz bolesnog vimena. U prilog toj tvrdnji mogu poslu~iti i rezultati istra~ivanja koje su proveli Takai i sur. (1990), Husu (1990), te Husu i sur. (1990). Ti su autori ustanovili listerije u sila~i, sijenu, koncentratu, stelji, izmetinama, praaini i tlu na farmama. Husu i sur. (1990) su listerije izdvojili iz obrisaka uzetih s povraine vimena prije pranja i suaenja. Nakon iaenja vimena obrisci su bili negativni. Na temelju toga autori zaklju uju da higijena u staji i izmuziatu smanjuje rizik zagaenja sirovog mlijeka listerijama. II.3. Opi podaci o bakteriji E. coli, serovar O157:H7 Eaerihije su bakterije oblika ravnih atapia, veli ine 1,1-1-5 x 2,0-6,0 m. Pojavljuju se pojedina no ili u parovima. Gibljive su pomou peritrihih flagela, a pojedini sojevi nisu gibljivi. Fakultativni su anaerobi. Proizvode katalazu, a ne tvore oksidazu (Anon. 1994) Bakterija E. coli redoviti je pripadnik crijevne mikroflore ljudi i veine toplokrvnih ~ivotinja. Pojedini serovarovi te bakterije uzrokuju gastrointesinalne tegobe, a infekcije tim serovarima povezane su sa uzimanjem zagaene hrane. S obzirom na virulenciju, interakcije s crijevnom sluznicom, klini ke simptome, epidemiologiju te posjedovanje somatskog (O) i fimbrijskog (H) antigena, patogeni se sojevi svrstavaju u enteropatogene, enteroinvazivne, enterotoksigene i enterohemoragi ne sojeve. Enterohemoragi ni sojevi (skra. EHEC) stvaraju jednu ili viae vrsta verotoksina (skra. VTEC). Najva~niji enterohemoragi ni serovarovi pripadaju seroloakim skupinama O26, O91, O111, O113 i O157 (Bettelheim, 1997). Meu njima po patogenosti za ljude isti e se serovar O157:H7, a prema pojedinim autorima sli ne promjene mo~e uzrokovati i negibljiva varijanta tog serovara O157:H-. Rezervoari tih sojeva su najvjerojatnije muzna goveda, posebno mlade ~ivotinje (Doyle, 1990, Montenegro, 1990). Sposobnost VTEC sojeva da in vitro invadiraju epitelne stanice vimena mogla bi biti va~na u patogenezi i ukazuje na mogui izvor one iaenja sirovog mlijeka tim sojevima (Matthews i sur. 1997). II.3.1. Bolest u ljudi uzrokovana serovarom O157:H7 Infekcija serovarom O157:H7 klini ki se u ljudi o ituje hemoragi nim kolitisom, hemoliti no uremi nim sindromom i znacima tromboti ne trombocitopeni ne purpure. Izvor infekcije ljudi naj eae je govee meso, a neato rjee sirovo kravlje mlijeko. Bolest uzrokovana serovarom O157 zabilje~ena je u viae zemalja, u Argentini, Australiji, `kotskoj, Kanadi, Sjedinjenim Ameri kim Dr~avama, itd. Najmasovnija pojava bolesti dogodila se u Japanu 1996., kada je obolilo pribli~no 9. 000 ljudi. II.4. Bakterije roda Salmonella u sirovom mlijeku II.4.1. Opi podaci o salmonelama Salmonele su svrstane u porodicu Enterobacteriaceae koja obuhvaa tridesetak rodova, s viae od 115 vrsta i podvrsta. Pripadnici te porodice su gram-negativne bakterije, srednje veli ine (0,4-0,6 x 2-3 m). Gibljive vrste posjeduju peritrihe flagele. Fermentiraju glukozu, stvaraju katalazu, ali ne i oksidazu. Sposobne su reducirati nitrate u nitrite i rasti na obi nom hranjivom agaru (Anon. 1994). Rod Salmonella obuhvaa viae od 2500 razli itih serovarova koji se meusobno razlikuju na temelju somatskih (O), flagelnih (H), a pojeidne i kapsularnog (Vi) antigena. U novije vrijeme salmonele su podijeljene u 7 podskupina ozna enih rimskim brojevima (to su skupine: I, II, IIIa, IIIb, IV, V i VI). Probavni trakt toplokrvnih i hladnokrvnih ~ivotinja je rezervoar salmonela. Veina inficiranih ~ivotinja postaju supklini ki izlu iva i salmonela. Salmonele su otporne na nepovoljne uvjete i dugo pre~ive u okoliau. Tako na primjer u vla~noj zemlji, vodi, izmetinama ~ivotinja te u sto noj hrani, posebice u krvnom, koatanom i ribljem braanu, pre~ive 9 mjeseci. Pri enteri nom obliku bolesti salmonele naseljavaju stra~nji dio tankog crijeva ili kolon domaina. Mikroflora crijeva zdrave ~ivotinje stvara organske kiseline koje sprje avaju rast salmonela. Poremeaji mikroflore probavnog sustava koji, primjerice, nastaju pri antibiotsko terapiji, oskudici hrane ili vode, poveavaju primljivost prema infekciji tim bakterijama. Pored toga, usporena peristaltika zbog stresa u transportu, ili prenatrpanost nastambe takoer pogoduju naseljavanju probavnog trakta salmonelama. Sojevi koji uzrokuju septikemiju u organizmu sposobni su izbjei obranu domaina tako ato se razmno~avaju u jetrenim i slezenskim makrofagima, te u krvnim ~ilama. Razmno~avanje salmonela u tijelu domaina dovodi do teake endotoksemije. ini se da su pojedini sojevi patogeniji od drugih. Izrazito patogeni sojevi esto se javljaju unutar serovarova S. typhi, S. dublin i S. typhimurium (Quinn i sur. 1994). II.4.2. Salmoneloza u ~ivotinja Salmoneloza u ~ivotinja mo~e se klini ki o itovati u viae oblika. Tako se u goveda oboljelih od salmoneloze nalazi enteritis, septikemija, meningitis (u teladi), poba aj, osteomijelitis, bolest zglobova, suha gangrena vraka uaiju, repa i udova (telad); a u ovaca: enteritis, septikemija i poba aj (Quinn i sur. 1994). II.4.3. Salmoneloza u ljudi U ljudi salmonele uzrokuju tri tipa probavnih bolesti: gastroenteritis, crijevnu groznicu i sindrom sepse. Meu naj eae uzro nike gastroenteritisa spominju se S. enteritidis i S. typhimurium. S. typhi, uzro nik trbuanog tifusa, predstavnik je skupine uzro nika crijevnih groznica. Sindrom sepse najrjei je oblik salmoneloze, a najaeae ga uzrokuje S. choleraesuis (Quinn i sur. 1994; Kaleni i sur., 1995). Prema istra~ivanjima provedenim u Kaliforniji (Richwald i sur. 1988) smatra se da koriatenje sirovog mlijeka u prehrani predstavlja rizik obolijevanja od salmoneloze. V. REZULTATI V.1. Higijenska kakvoa sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka V.1.1. Ukupni broj bakterija u pretra~enim uzorcima sirovog mlijeka Tablica 5. Razdioba uzoraka na temelju UBB/ml UBB*/ml< 50 00050 001-100 000100 001-1000 0001-3 x 1063-10 x 106: 10 x 106broj uzoraka7316161860 * ukupni broj bakterija Legenda: 1-do 50 000/ml; 2-50 001-100 000; 3-100 001-1x106; 4-1-3 x 106; 5- 3-10 x 106; 6- : 10 x 106 Tablica 6. Prikaz higijenske kakvoe pretra~enih uzoraka mlijeka u odnosu na Pravilnik UdovoljavaNe udovoljavaBroj4278%3565 Prosje ni broj bakterija u uzorcima koji su udovoljili norme Pravilnika iznosio je 834412/ml. V.1.2. Nalazi bakterija u pretra~enim skupnim uzorcima kozjeg i ov jeg mlijeka Tablica 7. Nalazi bakterija u skupnim uzorcima mlijeka Bakterijska skupinaukupnoKoliformne bakterije110Mikrokoki76Enterokoki61S.aureus 32Hemoliti na E. coli19Streptokoki C i E11Pseudomonas spp.11Bacillus spp.5Proteus spp.2Serratia marcescens2S. agalactiae1  V.3. Rezultati imunoenzimnih pretraga sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka Tablica 8. Rezultati imunoenzimnih i kulturelnih pretraga na Listeria spp. E. coli O157 i Salmonella spp. ELISA Pozitivno negativnoKulturelno Pozitivno negativnoUkupno pretra~enoListeria spp.11191119120E. coli O15721182*118120Salmonella spp.61140120120*O157:H-    III. MATERIJAL I METODE III.1. Podrijetlo uzoraka i podaci o ~ivotinjama Uzorci mlijeka su prikupljeni u obiteljskim gospodarstvima sjevernog i sjeverozapadnog podru ja Republike Hrvatske. Proizvodnja kozjeg i ov jeg mlijeka u ovom dijelu Hrvatske zapo ela je prije petnaestak godina. Meu pasminama mlije nih koza, najzastupljenije su koze u tipu alpske koze, a u znatno manjem broju koze u tipu sanske i kri~anci alpske i sanske koze. Pasminski sastav stada ovaca je jednoli an i ini ga isto nofrizijska ovca. Prosje na godianja proizvodnja mlijeka po kozi kree se od 500 do 700 litara, ovisno o broju prethodnih laktacija, hranidbi, zoohigijenskim uvjetima, itd. Laktacijsko razdoblje u koza iznosi oko 280 dana. Prosje na godianja proizvodnja mlijeka po ovci iznosi pribli~no 300 litara, a laktacijsko razdoblje traje oko 200 dana. }ivotinje se dr~e u tipski izgraenim ili preureenim objektima, pregraenim u boksove, u kojima je smjeateno 8-10 ~ivotinja. Veli ina stada kree se u rasponu od 20 do 60 ~ivotinja. Mu~nja se u najveem broju gospodarstava obavlja strojno, na ureenim izmuziatima, koja su vrlo rijetko potpuno odvojena od prostora u kojem borave ~ivotinje. Ru na mu~nja se obavlja u malom broju gospodarstava. Uzorci su uzimani iz kanti u koje je bilo skupljeno mlijeko jutarnje mu~nje svih ~ivotinja iz pojedinog stada. Ukupno je pretra~eno 105 skupnih uzorka kozjeg i 15 skupnih uzoraka ov jeg mlijeka. Trasportirani su u laboratorij u priru nim hladnjacima s ledom, a u laboratoriju su do obrade uvani u hladnjaku, pri temperaturi +4C. III.2. Hranjive podloge Tijekom izvedbe laboratorijskih pretraga koristili smo se s viae vrsta tekuih i vrstih hranjivih podloga. Od vrstih hranjivih podloga upotrebljavali smo: 1. Hranjivi agar s dodatkom laktoze 2. Eskulin-krvni agar (Blood agar base, Oxoid, s dodatkom 5 % defibrinirane ov je krvi i 1 % eskulina) 3. Krvni agar s dvostrukom koli inom eskulina (tzv. CAMP podloga 4. XLD agar (Gibco BRL) 5. TSI agar (engl. Triple Sugar Iron Agar, Gibco BRL) 6. Baird-Parker agar (Sanofi Dignostics Pasteur) 7. Oxford agar (Merck) 8. Sorbitol MacConkey agar (Merck) Od tekuih hranjivih podloga koristili smo: Listeria Enrichment Broth (skra. LEB, Merck) Modificirani Tryptone Soy Broth s novobiocinom (krat. mTSB, Merck) Puferiranu peptonsku vodu Tetrationat bujon Selenit-cistin bujon (Sanofi Diagnostics Pasteur) M-bujon (tekua hranjiva podloga s manitolom, Merck) III.3. Mikrobioloake i seroloake pretrage U laboratorijskoj obradi mlijeka izvedene su sljedee mikrobioloake i seroloake pretrage utvrivanje ukupnog broja bakterija opa bakterioloaka pretraga imunoenzimni test za dokazivanje nazo nosti listerija imunoenzimni test za dokazivanje nazo nosti bakterije E. coli O157 imunokromatografski test radi potvrivanja nazo nosti bakterije E. coli O157:H7 imunoenzimni test za dokazivanje nazo nosti salmonela III.3.1. Odreivanje ukupnog broja bakterija Odreivanje ukupnog broja bakterija obavili smo na hranjivom agaru s laktozom. Prije nacjepljivanja hranjive podloge skupne uzorke mlijeka dobro smo promijeaali, a potom na inili deseterostruka razrjeenja u epruvetama s fizioloakom otopinom NaCl. U prvoj epruveti 1 mL uzorka dodali smo na 9 ml sterilne fizioloake otopine NaCl (razrjeenje 1:10). Nakon temeljitog mijeaanja sadr~aja pomou laboratorijske tresilice, 1 mL ovako razrijeenog uzorka otpipetirali smo u sljedeu epruvetu i pomijeaali s 9 ml sterilne fizioloake otopine NaCl priredivai tako razrjeenja od 1:100 do 1:1 000 000. Potom smo u sterilne Petrijeve plo e otpipetirali po 1 mL od svakog razrjeenja i na to nalili pribli~no 25 ml otopljene vrste hranjive podloge (hranjivi agar s dodatkom laktoze) koja je ohlaena na 50 C. Kru~nim pokretanjem plo e na ravnoj podlozi izmjeaali smo mlijeko s podlogom. Tako nacijepljene plo e inkubirali smo 48 sati pri temperaturi 37 C, a nakon toga izbrojili porasle kolonije, koristei se pri tome broja em kolonija. Kolonije smo brojili na povraini cijele plo e u viae razrjeenja u kojima broj kolonija nije prelazio 300. Nakon toga smo izra unali ukupni broj bakterija u 1 mL pretra~ivanog mlijeka, uzevai u obzir srednju vrijednost. III.3.2. Opa bakterioloaka pretraga Radi utvrivanja prisutnosti bakterija uzorke mlijeka nacijepili smo na eskulin krvni agar, tako da smo 0,1 ml mlijeka nanijeli sterilnom pipetom na povrainu hranjive podloge, a zatim mlijeko sterilnim staklenim atapiem razmazali po cijeloj povraini plo e. Plo e s nacijepljenim mlijekom inkubirali smo 24 sata pri 37 C, a potom smo pristupili identifikaciji poraslih bakterija. Prema utvrenim morfoloakim karakteristikama kolonije smo precjepljivali na selektivne i diferencijalne hranjive podloge: XLD agar, TSIA agar, Baird-Parkerovu hranjivu podlogu, hranjivi agar s laktozom i eskulin krvni agar s dvostrukom koli inom eskulina, tzv. CAMP podlogu (vidjeti tablicu 1). U pretragama uzoraka mlijeka koji su imunoenzimnim testom dali pozitivan rezultat, upotrijebili smo Oxford-agar za izdvajanje listerija, sorbitol McConkey agar za bakteriju E. coli O157:H7, te XLD i TSIA agar za izdvajanje salmonela. Tablica 1. Hranjive podloge i testovi upotrebljeni u identifikaciji bakterija Skupina bakterijaBojenje po GramuHranjive podloge i testoviKoliformne bakterijeGramnegativni atapiiEskulin krvni agar, TSI agar, XLD agarStaphylococcus aureusGram + kugli aste bakterije u skupinamaEskulin krvni agar, Baird-Parker agar, hranjivi agar s laktozom, koagulaza testStreptococcus spp. Gram + kugli aste bakterije u nizovimaEskulin krvni agar, CAMP test, razgradnja eskulinaEnterococus spp. Gram + kugli aste bakterije u nizovimaEskulin krvni agar, CAMP test, razgradnja eskulinaMicrococcus spp. Gram + kugli aste bakterije u skupinamaEskulin krvni agar, Baird-Parker agar, hranjivi agar s laktozom, koagulaza testBacillus spp.Gram + ili varijabilne atapiaste bakterijeEskulin krvni agarPseudomonas spp.Gram - atapiaste bakterije Eskulin krvni agar, TSIA agar, XLD agar III.3.3. Imunoenzimni test za dokazivanje listerija (Tecra Listeria Visual Immunoassay, Noack) Tecra Listeria Visual Immnoassay (TLVIA) je brzi i specifi ni test za otkrivanje listerija u prethodno obogaenim uzorcima hrane i uzorcima materijala iz okoliaa ~ivotinje. Pozitivni nalaz treba potvrditi pretragom uzorka standardnim bakterioloakim metodama. U testu se koriste poliklonska protutijela adsorbirana na stijenku ja~ice, koja omoguavaju dokazivanje bilo koje vrste iz roda Listeria, nakon postupka selektivnog obogaivanja. Prema uputama proizvoa a, test je vrlo specifi an za listerije, nema unakri~nih reakcija ak ni s blisko srodnim gram-pozitivnim bakterijama. Meutim, prema navodima AOAC (Association of Official Analytical Chemists), zbog uporabe poliklonskih protutijela pokatkad se ipak javljaju unakri~ne reakcije sa antigenski srodnim bakterijama. U rujnu 1995. AOAC je odobrio primjenu Tecra Listeria VIA za pretragu mlije nih proizvoda, mesa sisavaca, mesa peradi, hrane podrijetlom iz mora i lisnatog povra. III.3.3.1. Predobogaivanje uzoraka Prije izvoenja pretrage imunoenzimnim testom potrebno je provesti obogaivanje uzorka da bi se listerije, ako su prisutne razmno~ile do broja koji je mogue otkriti. U tu smo se svrhu koristili tekuom hranjivom podlogom Listeria Enrichment Broth (LEB, Merck). Shematski prikaz postupka obogaivanja mlijeka i mlije nih proizvoda: 25 g ili 25 ml uzorka nacijepiti u 225 ml Listeria Enrichment Broth ! Inkubirati pri 30 C u tijeku 24 sata ! 1 ml inkubiranog uzorka precijepiti u 9 ml LEB ili Fraser bujona ! Inkubirati 22-24 sata pri 30 C ! Tecra Listeria VIA III.3.3.2. Na ela testa Tecra Listeria VIA je imunoenzimni  sendvi  test. Visokospecifi na protutijela za listerije vezana su na stijenke ja~ica. Ako su prisutni u uzorku, antigeni listerija bivaju  uhvaeni protutijelima. Ostali sastojci uzorka budu isprani.  Sendvi  test se kompletira dodavanjem protutijela za listerije koja su ozna ena enzimom (konjugat). Pojava zelene boje u supstratu pod djelovanjem vezanog enzima u konjugatu upuuje na prisutnost listerija. Ako nema listerija, supstrat ne mijenja boju. III.3.3.3. Potrebni sastojci za provedbu testa Sastojci (kompleta) kita: Koncentrirana tekuina za ispiranje Pozitivna kontrola Kontrolni razrjeiva  (negativna kontrola) Konjugat Razrjeiva  konjugata Supstrat Razrjeiva  supstrata  Stop otopina Ja~ice s adsorbiranim protutijelima Aditiv za uzorke Samoljepljiva traka Dr~a  ja~ica Tekst s uputama Tablica za obilje~avanje uzoraka Kartica za usporedbu boja Ostali materijal potreban za izvoenje testa: Termostat s temperaturom 35-37 C Seroloake pipete (1 ml) Plasti ne boce sa zavrtnjem (500 ml) Mikropipete 20 L, 50 L i 200 L Nastavci za mikropipete Samoljepljiva vrpca Vodena kupelj (100 C) Epruvete ili bo ice sa zavrtnjem (5 mL) prikladne za grijanje uzoraka III.3.3.4. Priprema sastojaka za uporabu Tekuina za ispiranje Koncentriranu tekuinu za ispiranje razrijedili smo s 2 L deionizirane vode. Za ispiranje ja~ica preporu uju se plasti ne boce sa zavrtnjem i airokim grlom. Otopinu za ispiranje treba uvati pri 4 C. Posuda u kojoj se otopina uva mora se temeljito o istiti prilikom svakog koriatenja. Da se ato viae smanji opasnost od kontaminacije otopinu smo pripremali pomou sterilizirane vodu. Pozitivna kontrola Jednim zahvatom prenijeli smo 3 mL kontrolnog razrjeiva a u bo icu s  pozitivnom kontrolom. Zatvorili smo bo icu najprije originalnim gumenim epom a potom epom sa zavrtnjem te dobro promukali. Pozitivna kontrola sadr~ava antigene listerija, koji daju pozitivnu reakciju. Negativna kontrola Preostali razrjeiva  koji je ostao nakon pripreme pozitivne kontrole koristili smo kao  negativnu kontrolu (negativna reakcija). Konjugat U svakom kompletu su prilo~ena 2 seta konjugata (enzimom ozna ena protutijela za listerije) i razrjeiva a konjugata zbog razmjerno kratkog vijeka valjanosti pripremljenog konjugata (1 mjesec). U bo icu s konjugatom prelili smo cijeli sadr~aj jedne bo ice razrjeiva a. Pripremljeni konjugat ostavili smo na sobnoj temperaturi da se potpuno otopi. Supstrat U bo icu sa supstratom dodali smo razrjeiva  supstrata. Razrijeeni supstrat je bezbojan ili blijedo zelene boje. Dodatak uzorku i  stop otopina Ovi pripravci spremni su za uporabu bez prethodne pripreme. III.3.3.5. Izvoenje testa Svi sastojci kompleta moraju se prije uporabe zagrijati na sobnu temperaturu. Prvi stupanj: toplinska obrada uzorka Otpipetirati 1 mL obogaenog uzorka u ozna enu epruvetu. Preostali dio uzorka treba sa uvati za potvrdu pozitivnog rezultata imunoenzimnog testa. Potom se u epruvetu doda 50 L dodatka (engl. sample additive), promijeaa te kuha u vodenoj kupelji 15 minuta. Umjesto kuhanja, uzorak se mo~e dr~ati 15 min. u autoklavu pri 100 C pazei da se ne podigne tlak Toplinski obraene uzorke treba ohladiti na sobnu temperaturu. Drugi stupanj: priprema ja~ica Za svaki uzorak treba osigurati po jednu ja~icu. Pored toga, po jednu ja~icu treba osigurati za pozitivnu i negativnu kontrolu. Odvojene ja~ice stave se u dr~a , koji je sastavni dio kompleta. Trei stupanj: ukapavanje uzorka Mikropipetom se otpipetira 200 L uzorka i jednako toliko kontrolnog pozitivnog i negativnog uzorka u odgovarajue ja~ice. Pri tome treba za svaki uzorak koristiti novi nastavak mikropipete. Polo~aj svakog uzorka treba zabilje~iti u prilo~enoj tablici. Ja~ice se prekriju ljepljivom trakom i inkubiraju u termostatu 30 minuta pri 35-37 C. etvrti stupanj: prvo ispiranje Temeljito ispiranje ja~ica je kriti ni stupanj o kojem ovisi tuma enje rezultata. Izlijevanje sadr~aja ja~ica Ja~ice moraju biti vrsto utisnute u dr~a  kako ne bi ispale tijekom ispiranja. Brzim okretanjem dr~a a sadr~aj ja~ica izlije se u posudu za otpadnu tekuinu. Ostaci sadr~aja odstrane se udaranjem dr~a a s otvorima ja~ica okrenutim prema dolje po sloju stani evine. Punjenje ja~ica otopinom za ispiranje Pomou boce airokog grla treba ispuniti svaku ja~icu tekuinom za ispiranje, pazei da u ja~icama ne zaostanu mjehurii zraka. Ispiranje i potpuno pra~njenje ja~ica treba ponoviti 3 puta. Peti stupanj: dodavanje konjugata U svaku ja~icu treba dodati po 200 L konjugata. Ja~ice se pokriju ljepljivom vrpcom i inkubiraju 30 min pri 35-37 C. `esti stupanj: drugo ispiranje Temeljito ispiranje ulijevanjem tekuine za ispiranje i pra~njenjem ja~ica na ovom stupnju treba ponoviti 4 puta. Sedmi stupanj: dodavanje supstrata U svaku ja~icu doda se po 200 L supstrata i inkubira pri sobnoj temperaturi (20-25 C). Prilikom inkubiranja treba izbjei kolebanja temperature izvan navedenih granica. Kako supstrat mijenja boju u blizini stijenki ja~ica, prije o itavanja rezultata laganim kuckanjem po dr~a u treba promijeaati sadr~aj da se jednoli no oboji. Inkubirati treba najmanje 15 minuta, a tek potom o itati rezultat. Kad se boja pozitivne kontrole izjedna i s bojom broj 4 na prilo~enoj kolor kartici, koja je sastavni dio kita, ili ako opti ka gustoa pozitivne kontrole o itana automatskim ita em iznosi najmanje 1.0 pristupa se izvoenju osmog stupnja. Osmi stupanj: dodavanje  stop otopine Dodati 20 L stop otopine u svaku ja~icu. Sadr~aj ja~ice promijeaa se laganim kuckanjem po dr~a u. Deveti stupanj: o itavanje rezultata Rezultati se mogu o itati pomou kolor kartice koja je sastavni dio kita, ili pomou automatskog ita a. O itavanje pomou kolor kartice Dr~a  s umetnutim ja~icama postavi se na bijelu podlogu, a zatim se boja u svakoj pojedina noj ja~ici usporeuje s bojama na kolor kartici. Da bi test bio valjan, moraju se ispuniti dva uvjeta: a) nijansa boje pozitivne kontrole mora odgovarati boji br.4 na kontrolnoj kartici ili biti tamnija b) obojenost negativne kontrole mora biti unutar negativnog raspona uzoraka boja kolor kartice. Ako ovi kriteriji nisu zadovoljeni, rezultati se ne smatraju valjanima i cijeli postupak treba ponoviti. Rezultat se smatra negativnim, ako test udovoljava prethodnim uvjetima, a boja sadr~aja ja~ice pripada negativnom rasponu boja kolor kartice. Rezultat se smatra pozitivnim, ako udovoljava navedenim uvjetima, a ja ina obojenosti sadr~aja ja~ice je jednaka ili vea od intenziteta boje br. 3 na kontrolnoj kartici. Uporaba automatskog ita a Opti ka gustoa uzorka mo~e se odrediti pomou zraka valne duljine 41410 nm. Test se dr~i valjanim ako su zadovoljena dva uvjeta: a) opti ka gustoa pozitivne kontrole mora iznosi najmanje 1.0, a b) opti ka gustoa negativne kontrole iznosi najviae 0.2 Ishod testa smatra se negativnim, ukoliko opti ka gustoa uzorka iznosi manje od 0.2. Rezultat se smatra pozitivnim, ukoliko opti ka gustoa uzorka iznosi viae od 0.2. U naaem istra~ivanju rezultate imunoenzimnih testova o itavali smo na Anthos ht II fotometru uz uporabu filtra od 405 nm. Deseti stupanj: potvrda pozitivnih uzoraka Pozitivne rezultate pretrage treba potvrditi nacjepljivanjem obogaenog uzorka na selektivne hranjive podloge, a porasle kulture bakterija treba identificirati primjenom biokemijskih i seroloakih pretraga. III.3.4. Imunoenzimni testovi za dokazivanje bakterije E. coli O157 (Tecra E. coli O157 Visual Immunoassay, Noack i Glisa Singlepath E.coli O157:H7) Tecra E.coli O157 VIA je brzi test za otkrivanje nazo nosti bakterije E.coli O157 u uzorcima namirnica i uzorcima iz okoliaa ~ivotinje. Test je visoko specifi an za bakteriju E.coli O157. Budui da Tecra E. coli O157 Via otkriva sojeve koji sadr~e somatski antigen O157, radi utvrivanja je li rije  o gibljivom serovaru koji sadr~i flagelarni antigen H7, pozitivne uzorke pretra~ili smo dodatnim testom Glisa Singlepath E. coli O157:H7 (engl. Gold Labelled ImmunoSorbent Assay) za kvalitativno utvrivanje prisutnosti bakterije E. coli O157:H7 (Merck). III.3.4.1. Predobogaivanje uzoraka Kao i kod prethodno opisanog imunoenzimnog testa za otkrivanje listerija, najprije je potrebno pretra~ivani uzorak obogatiti na selektivnoj tekuoj hranjivoj podlozi (bujonu). Za predobogaivanje mlijeka i mlije nih proizvoda koristili smo se tekuom hranjivom podlogom modificiranim puferiranim tripton soja bujonom s novobiocinom (mTSB, Merck). Shema obogaivanja uzorka za imunoenzimni test Tecra E. coli O157 VIA i imunokromatografski test Glisa Singlepath E. coli O157:H7 g ili ml uzorka nacijepiti u 225 ml mTSB ! inkubirati pri 421C u tijeku 18-24 sata ! Tecra E. coli O157 Via III.3.4.2. Izvoenje testa Tecra E. Coli O157 Via Sadr~aj kompleta Tecra E. Coli O157 Via, priprema sastojaka potrebnih za taj test, izvoenje samog testa, procjena valjanosti testa, o itavanja rezultata te potvrda pozitivnog ishoda pretrage uzorka identi ni su kao kod testa Tecra Listeria Via. III.3.5. Izvoenje testa GLISA Singlepath E. coli O157:H7 III.3.5.1. Na ela testa GLISA Singlepath E.coli O157:H7 je brzi imunokromatografski test koji se temelji na uporabi ozna enih protutijela. Test je tehni ki izveden tako da na plasti nom atapiu ima kru~nu zonu u koju se ukapava pretra~ivani uzorak, pravokutnu testnu zonu i ovalnu kontrolnu zonu. Uzorak se mora prethodno obogatiti na selektivnoj tekuoj hranjivoj podlozi. Za obogaivanje se koristi hranjiva podloga jednakog sastava kao i za ELISA test (mTSB s novobiocinom). Uzorak se ukapa u kru~ni otvor papirnate povraine atapia Uzorak se apsorbira u papirni umetak, koji u podru ju reakcije sadr~ava koloidna ozna ena specifi na protutijela za E. coli O157:H7. Prisutni antigeni E. coli O157:H7 ve~u se s ozna enim protutijelima i putuju dok ne budu  uhvaeni u reakcijskom podru ju testne zone Sekundarna protu-E.coli O157:H7 antigen-protutijela su uklju ena u reakcijskom podru ju. Ona ve~u antigen-protutijelo kompleks. Zahvaljujui ozna enim protutijelima, ako je reakcija pozitivna, postaje vidljivom crvena crta. Ostatak uzorka nastavlja putovati do drugog reakcijskog podru ja unutar kontrolne zone, u kojoj oblikuje vidljivu crvenu crtu koja slu~i kao pozitivna kontrola. Bez obzira sadr~i li uzorak bakteriju E. coli O157:H7 ili ne sadr~i, crvena crta u kontrolnoj zoni mora se uvijek se pojaviti kao dokaz valjanosti testa. III.3.5.2. Provedba testa: Iz originalnog pakovanja izvaditi potreban broj testova i ozna iti ih. Test se mora izvesti u razdoblju do najviae 2 sata nakon ato je otpakiran. Prilo~enom pipetom za jednokratnu uporabu uzeti uzorak iz obogaenog materijala Tri kapi uzorka (pribli~no 100 L) ukapati u kru~nu zonu Rezultat se o ita nakon 20 minuta. III.3.5.3. Tuma enje rezultata: Test se smatra ispravno provedenim, ako se nakon 15-20 minuta u kontrolnoj zoni pojavi jasno uo ljiva crvena crta. Rezultat testa smatra se pozitivnim ako se u roku 15-20 minuta, ili ranije, pojavi vidljiva crvena crta u kontrolnoj i u testnoj zoni. Rezultat testa smatra se negativnim, ako se u roku 15-20 minuta crvena crta pojavi u kontrolnoj, a ne i u testnoj zoni. III.3.6. Imunoenzimni test za dokazivanje salmonela (Tecra Salmonella Visual Immunoassay, Noack) Test je namijenjen otkrivanju bakterija roda Salmonella u svim vrstama hrane. Temelji se na uporabi poliklonskih protutijela vezanih na stijenku ja~ica. Prema navodima AOAC standarda koji je odobrio metodu kao  screening test, u odreenom broju uzoraka mo~e doi do unakri~nih reakcija s bakterijama koje ne pripadaju rodu Salmonella. Zbog toga svaki uzorak koji je dao pozitivnu reakciju ovim testom treba pretra~iti kulturelno. III.3.6.1. Obogaivanje uzoraka Obogaivanje uzoraka izvodi se prema shemi obogaivanja koja se preporu uje za proizvode s vjerojatno visokom koncentracijom mikroorganizama, kao ato su npr. sirovo meso, riba, perad, sirovo mlijeko. Od tekuih hranjivih podloga za obogaivanje koristili smo puferiranu peptonsku vodu, tetrationat bujon, selenit-cistin bujon i M-bujon. Shema obogaivanja uzoraka sirovog mlijeka tijekom pripreme za imunoenzimni test: PREDOBOGAIVANJE 25 g ili 25 ml uzorka nacijepiti u 225 ml puferirane peptonske vode ! inkubirati 18-22 sata pri 35-37 C ! SELEKTIVNO OBOGAIVANJE 1ml inkubirane kulture nacijepiti u 9 ml tetrationat bujona 1 ml inkubirane kulture nacijepiti u 9 ml selenit-cistin bujona ! inkubirati 6-8 sati pri 35-37 C ! DODATNO OBOGAIVANJE 1 mL inkubiranog TTB nacijepiti u 10 mL M-bujona 1 mL inkubiranog SCB nacijepiti u 10 mL M-bujona ! inkubirati 16-20 sati pri 35-37 C ! Tecra Salmonella Via III.3.6.2. Izvoenje testa Tecra Salmonella Via se razlikuje od prethodnih dvaju imunoenzimnih testova po tome ato komplet ne sadr~ava dodatak uzorku (engl.  sample aditive ) pa se na prvom stupnju uzorak kuha bez dodatka. Uzorak zapremine 1 ml dobije se tako da se pomijeaa 0,5 ml M-bujona nacijepljenog prethodno obogaenim tetrationat bujonom i 0,5 ml M-bujona nacijepljenog prethodno obogaenim selenit-cistin bujonom. Ostali postupci s obzirom na na in izvoenja i trajanje isti su kao u prethodno opisanim imunoenzimnim testovima, ali razlike postoje u o itavanju rezultata. Naime, rezultat testa smatra se negativnim ukoliko opti ka gustoa uzorka iznosi manje od 0.3, a pozitivnim, ukoliko opti ka gustoa uzorka iznosi viae od 0.3. III.3.7. Koagulaza-test Bakterijske kolonije koje na krvnom agaru s eskulinom izgledom odgovaraju kolonijama stafilokoka precijepe se na hranjivi agar s laktozom i Baird-Parkerovu hranjivu podlogu, te se inkubiraju 24 sata pri 37C. Tako dobivena bakterijska kultura (oko 10 kolonija) suspendira se u 0.5 ml nerazrijeene kunije plazme i inkubira se pri 37C. Bakterijske kulture koje su izazvale gruaanje plazme, proglasili smo vrstom Staphylococcus aureus. III.3.8. CAMP-test Kolonije koje su morfoloakim svojstvima odgovarale kolonijama streptokoka, podvrgnuli smo CAMP-testu. Na krvni agar s dvostrukom koli inom eskulina nacijepili smo u obliku pruge hemoliti ni soj bakterije S. aureus cijelim promjerom Petrijeve plo e. Okomito na ovu prugu, na udaljenosti od nekoliko milimetara nacjepljivali smo izdvojene sojeve streptokoka. Nakon inkubacije od 24 sata pri 37C, promatrali smo mofoloake osobine poraslih kolonija: oblik, veli inu, boju, izgled povraine, stvaranje CAMP fenomena, hemolizu i hidrolizu eskulina. Na temelju ovih svojstava, pretra~ivane sojeve razvrstali smo u skupine streptokoka ili enterokoka. III.4. Istra~ivanje osjetljivosti imunoenzimnih testova za dokazivanje salmonela i listerija Dio naaih istra~ivanja odnosio se je na osjetljivost imunoenzimnih testova u otkrivanju salmonela i listerija. U tu svrhu koristili smo 24-satne bujonske kulture identificiranih serovarova S. typhimurium i S. enteritidis, te neidentificirane sojeve listerija izdvojene iz kravljeg sira i sirovog ov jeg mlijeka. Budui da se upotrebljeni ELISA testovi osnivaju na uporabi poliklonskih protutijela, mogue su unakri~ne reakcije s antigenski srodnim bakterijama. S tog smo razloga na inili pokus s laboratorijskim sojevima bakterijama Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter cloacae. Upotrijebljeni sojevi tih bakterija izdvojeni su iz uzoraka sekreta vimena krava s mastitisom ili iz skupnih uzoraka mlijeka, dostavljenih u Odjel za mastitise i kakvou sirovog mlijeka Hrvatskog veterinarskog instituta. U osnovi, u tim su pokusima imunoenzimni testovi izvedeni na jednaki na in kao pri pretrazi terenskih uzoraka. III.4.1. Istra~ivanje osjetljivost imunoenzimnog testa Tecra Salmonella VIA Cilj ovog dijela pokusa bio je da se utvrdi koliko bakterijskih stanica treba sadr~avati uzorak prije obogaivanja da se mogu pouzdano dokazati imunoenzimnim testom. U tu svrhu na inili smo sljedei pokus. Pripremili smo niz od 13 epruveta. U prvu smo otpipetirali 29 mL, a u preostalih 12 po 27 mL sterilnog kozjeg mlijeka. Potom smo u prvu epruvetu dodali 1 mL suspenzije bakterija. Suspenziju smo pripremili tako dao smo u 10 mL fiziloke otopine stavili 1 kap 24-satne bujonske kulture. Upotrebljene kulture bakterija to smo ih koristili u pokusu uzgojene su na selenit-cistin bujonu. Nakon temeljitog mijeaanja sadr~aja prve epruvete, 3 mL promijeaanog sadr~aja otpipetirali smo u sljedeu epruvetu niza, na inivai tako deseterostruka razrjeenja. Taj smo postupak ponovili do kraja cijelog niza. Svako od tako pripremljenih razrjeenja obradili smo kao poseban uzorak prema shemi predobogaivanja uzorka sirovog kozjeg mlijeka na strani Istodobno smo od suspenzije bakterija na inili deseterostruka razrjeenja u fizioloakoj otopini radi utvrivanja ukupnog broja bakterija u suspenziji. Po 1 mL serijskih razrjeenja otpipetirali smo u sterilne Petrijeve plo e, prelili ga s otprilike 25 ml XLD agara ohlaenog na 50 C te kru~nim pokretima izmijeaali. Plo e smo inkubirali 24 sata pri 37 C, a nakon toga smo pristupili brojenju poraslih kolonija, koristei se pritom broja em kolonija. Broj bakterija u suspenziji i serijskim razrjeenjima mlijeka za pojedine bakterije prikazan je u tablici 2. Napominjemo da su u tablici prikazane vrijednosti broja bakterija do razrjeenja 1:106 iako smo uzorke razrjeivali do vrijednosti 1:1012 Tablica 2. Broj bakterija u serijskim razrjeenjima mlijeka upotrijebljenim u pokusu Vrsta bakterijeBroj bakterija u 1 ml suspenzijeBroj bakterija u serijskim razrjeenjima mlijeka (BB/ml)Po etak 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6S. typhimu- rium24000080008008080,8 (8 u 10 mL)0,08 (8 u 100 mL)0,008 (8 u 1000 mL)S. enteritidis18000060006006060,6 (6 u 10 mL)0,06 (6 u 100 mL)0,006 (6 u 1000 mL)E. cloacae3000010001001010,1 (1 u 10 mL)0,01 (1 u 100 mL)0,001 (1 u 1000)E. coli10000333333,30,33 (3 u 10 mL)0,03 (3 u 100 mL)0,003 (3 u 1000)P. aeruginosa400013313,31,330,133 13 u 100 mL0,0133 13 u 1000 mL III.4.2. Istra~ivanje osjetljivosti imunoenzimnog testa TECRA Listeria VIA Po istom na elu kao za salmonele na inili smo pokus za istra~ivanje osjetljivosti imunoenzimnog testa za dokazivanje listerija. U istra~ivanju smo koristili 2 soja listerija iz vlastite zbirke sojeva: jedan izdvojen iz kravljeg sira, a drugi iz sirovog ov jeg mlijeka. Suspenziju bakterija dobili smo dodavanjem jedne kapi 24-satne bujonske kulture, uzgojene u hranjivoj podlozi Listeria Enrichment Broth (Merck) u 10 mL fizioloake otopine. Nakon temeljitog mijeaanja na laboratorijskoj tresilici 1 mL suspenzije otpipetirali smo u epruvetu s 29 mL sterilnog kozjeg mlijeka. Nakon mijeaanja, 3 mL sadr~aja prenijeli smo u slijedeu epruvetu s 27 mL mlijeka, priredivai tako deseterostruko razrjeenje. Ovaj postupak ponavljali smo do kraja niza, to jest do razrjeenja 10-12. Svako razrjeenje tretirali smo kao poseban uzorak: 25 mL nacijepili smo u 225 mL LEB, inkubirali 22-24 sata, a potom 1 mL precijepili u 9 mL LEB, inkubirali daljnja 22-24 sata te smo nakon toga pristupili izvoenju imunoenzimnog testa. Tablica 3. Pretpostavljeni broj bakterija roda Listeria u serijskim razrjeenjima mlijeka Soj Broj bakterija u 1 mL suspenzijeBroj bakterija u serijskim razrjeenjima mlijeka (BB/ml)Po etno 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7& razrjeenjeSoj izdvojen iz mlijeka15000005000050005005050,5 (5 u 10 mL)0,05 (5 u 100 mL)0,005 (5 u 1000 mL)Soj izdvojen iz sira3000001000010001001010,1 (1 u 10 mL)0,01 (1 u 100 mL)0,001 (1 u 1000 mL) V. REZULTATI V.1. Higijenska kakvoa sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka V.1.1. Ukupni broj bakterija u pretra~enim uzorcima sirovog mlijeka Tablica 5. Razdioba uzoraka na temelju UBB/ml UBB*/ml< 50 00050 001-100 000100 001-1000 0001-3 x 1063-10 x 106 10 x 106broj uzoraka7316161860 * ukupni broj bakterija Legenda: 1-do 50 000/ml; 2-50 001-100 000; 3-100 001-1x106; 4-1-3 x 106; 5- 3-10 x 106; 6- 10 x 106 Tablica 6. Prikaz higijenske kakvoe pretra~enih uzoraka mlijeka u odnosu na Pravilnik UdovoljavaNe udovoljavaBroj4278%3565 Prosje ni broj bakterija u uzorcima koji su udovoljili norme Pravilnika iznosio je 834412/ml. V.1.2. Nalazi bakterija u pretra~enim skupnim uzorcima kozjeg i ov jeg mlijeka Tablica 7. Nalazi bakterija u skupnim uzorcima mlijeka Bakterijska skupinaukupnoKoliformne bakterije110Mikrokoki76Enterokoki61S.aureus 32Hemoliti na E. coli19Streptokoki C i E11Pseudomonas spp.11Bacillus spp.5Proteus spp.2Serratia marcescens2S. agalactiae1  V.3. Rezultati imunoenzimnih pretraga sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka Tablica 8. Rezultati imunoenzimnih i kulturelnih pretraga na Listeria spp. E. coli O157 i Salmonella spp. ELISA Pozitivno negativnoKulturelno Pozitivno negativnoUkupno pretra~enoListeria spp.11191119120E. coli O15721182*118120Salmonella spp.61140120120*O157:H-    V.4. Osjetljivost imunoenzimnih testova U drugom dijelu naaeg rada istra~ili smo osjetljivost imunoenzimnih testova za salmonele i listerije na na in opisan u poglavlju materijal i metode. Uzorke smo pretra~ili ELISA testom i kulturelno. Rezultati su prikazani u tablicama. Tablica 9. Rezultati imunoenzimnih testova za salmonele i listerije razrjeenjePo .10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-1010-1110-12bakterijaS. typhimurium+++++++------S. enteritidis++++++-------Enterobacter cloacae--+++--+-----E. coli-++-Pseudomonas aeruginosa----Listeria sp.(iz mlijeka)+++++++------Listeria sp (iz sira)+++++-------- Tablica 10. Rezultati mikrobioloke pretrage uzoraka razrjeenjePo .10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-1010-1110-12bakterijaS. typhimurium++++++-------S. enteritidis++++++-------Enterobacter cloacae+++++++------E. coli++++++++-----P aeruginosa+++++--------Listeria sp.(iz mlijeka)++++++-------Listeria sp (iz sira)+++++-------- VI. RASPRAVA VI.1. Higijenska kakvoa mlijeka VI.1.1. Ukupni broj bakterija Kao ato je ranije ve spomenuto, standardi za sirovo mlijeko prema Pravilniku iz 1983. dopuatali su najviae 3 milijuna bakterija u 1 ml mlijeka. U naaem istra~ivanju norme Pravilnika zadovoljilo je samo 35% pretra~enih uzoraka. Prosje ni broj bakterija u uzorcima koji su zadovoljili higijenske uvjete iznosio je 834412/ml. Naa rezultat bitno se razlikuje od rezultata Majia i sur. (1998) koji su na 912 uzoraka mlijeka koza utvrdili prosje no 260586 bakterija u 1 ml mlijeka. Smatramo da je nepovoljno stanje glede mikrobioloake kakvoe pretra~enog mlijeka posljedica u higijenskom smislu neodgovarajueg pristupa mu~nji i rukovanju mlijekom. Naime, prilikom vlastitog posjeta obiteljskim gospodarstvima primjetili smo da se dezinficijensi vrlo rijetko upotrebljavaju. Pored toga, u domainstvima koja se opskrbljuju vodom iz vlastitih bunara i izvora, higijenska kakvoa vode esto je upitna. VI.1.2. Zastupljenost pojedinih rodova bakterija u pretra~enim uzorcima mlijeka `to se ti e zastupljenosti pojedinih rodova i vrsta bakterija u sirovom mlijeku iz prikaza rezultata vidljivo je da je 91,6 % pretra~enih uzoraka sadr~avalo pripadnike skupine koliformnih bakterija. Radi usporedbe navodimo da su u sli nim istra~ivanjima provedenim u inozemstvu koliformne bakterije takoer bile najzastupljenija bakterijska skupina u pretra~ivanim uzorcima sirovog mlijeka. Tako Desmasures i sur. (1997) navode da su spomenutu skupinu bakterija izdvojili iz veine pretra~enih uzoraka s 27 farmi u Normandiji. U istom istra~ivanju Staphylococcus aureus izdvojen je iz 62% uzoraka, ato je znatno viae nego u naaem istra~ivanju (26,6%). U istra~ivanju provedenom i Irskoj, Rea i sur. (1992) utvrdili su nazo nost koliformnih bakterija u svim pretra~enim uzorcima. U istra~ivanju Suareza i Ferreirosa (1991), nazastupljenija skupina gram-pozitivnih bakterija bili su mikrokoki. Autori su spomenutu skupinu bakterija izdvojili iz 44% uzoraka, ato je manje nego u naaem istra~ivanju (63,3%). Smatramo da je ovako nepovoljno stanje u pogledu higijenske kakvoe posljedica loaeg higijenskog pristupa mu~nji i manipulaciji mlijekom. Mialjenja smo da se stanje mo~e bitno popraviti u relativno kratkom roku. Uporiata za ovu tvrdnju proizlaze iz istra~ivanja }ivkovia i Asaja (1973), Asaja i sur. (1974) te }ivkovia i sur. (1974) koji su primjenom higijenskih postupaka na vimenu, muznom stroju i staji uspjeli znatno smanjiti po etno zagaenje mlijeka. Negativan utjecaj loaijih uvjeta dr~anja ~ivotinja na higijensku kakvou mlijeka mo~e se kompenzirati boljom higijenom u izmuziatu (Rabold i sur. 1990). VI.1.3. U estalost listerija u pretra~enim uzorcima sirovog mlijeka `to se ti e nazo nosti listerija u sirovom mlijeku, u domaoj literaturi nema podataka o takvim istra~ivanjima. Meutim, strana literatura obiluje podacima o nalazu listerija u mlijeku i mlije nim proizvodima. esto se podaci iz razli itih dijelova svijeta meusobno bitno razlikuju. Tako Harvey i Gilmour (1992) navode da su u istra~ivanju provedenom u Sjevernoj Irskoj, listerije utvrene u 25% pretra~enih uzoraka sirovog mlijeka, a te su bakterije izdvojene i iz jednog od 99 pretra~enih uzoraka pasteriziranog mlijeka te iz jednog od 33 pretra~ena uzorka mekog sira. Rea i sur. (1992) iznose podatak da su listerije u Irskoj izdvojene iz 8,3% pretra~enih uzoraka sirovog mlijeka, ali su pritom utvrene sezonske varijacije. Naime, tijekom proljea i ljeta u estalost nalaza listerija varirala je od 0 5%, a tijekom zimskog perioda iznosila je 35 37%. Prema podacima japanskih istra~iva a (Yoshida i sur., 1998) u estalost Listeria spp. u sirovom mlijeku s tamoanjih farmi iznosila je 3,1% (29 od 943 uzorka). U 5,8% uzoraka sirovog mlijeka porijeklom s 27 farmi u Normandiji utrena je vrsta Listeria monocytogenes (Desmasures i sur.,1997). Casarotti i sur. (1994) izvjeauju da u istra~ivanju provedenom u Brazilu u 20 uzoraka sirovog mlijeka nisu ustanovili pripadnike roda Listeria. Druga skupina autora iz te zemlje (Moura i sur. 1993) navodi da su iz ukupno 12,7% uzoraka sirovog mlijeka i iz 0,9% uzoraka pasteriziranog mlijeka izdvojene bakterije roda Listeria. Massa i sur. (1990) istra~ivali su prisutnost listerija u mekom siru, maslacu i sirovom mlijeku u pokrajini Bologna (Italija). Iz ukupno 40 pretra~enih uzoraka sirovog mlijeka nisu izdvojili bakterije roda Listeria. Fenlon i Wilson (1989) navode da su bakteriju L. monocytogenes izdvojili iz 3,8 % pretra~enih uzoraka mlijeka iz mlije nih spremnika na sjeveroistoku `kotske. Farber i sur. (1988) istra~ivali su prisutnost Listeria spp. u sirovom mlijeku iz mlije nih spremnika u pokrajini Ontario (Kanada). Autori su izdvojili Listeria spp. iz ukupno 12,4% pretra~enih uzoraka, dok su Steele i sur. (1997) u istoj pokrajini utvrdili nazo nost L. monocytogenes u 2,73% pretra~enih uzoraka. Margolles i sur. (1997) navode da su iz 11,8% pretra~enih uzoraka lokalnih apanjolskih sireva izdvojili listerije. Usporedbom navedenih podataka s rezultatima naaeg istra~ivanja mo~e se zaklju iti da je u estalost listerija utvrena naaim istra~ivanjem relativno rijetka. No, treba rei da postoji realna opasnost po ljudsko zdravlje u slu aju koriatenja sirovog mlijeka ili sira proizvedenog od sirovog mlijeka u prehrani ljudi, zbog rasprostranjenosti listerija u okoliau. Soj listerije koji smo izdvojili tijekom naaeg istra~ivanja potjecao je iz sirovog ov jeg mlijeka. Na eskulin krvnom agaru stvarao je usku zonu hemolize oko kolonije, a u CAMP testu s bakterijom Staphylococcus aureus nije stvarao CAMP fenomen. U razmascima obojenim po Gramu bojio se pozitivno, a oblika je kratko atapiastog. VI.1.4. Bakterija E. coli O157:H7 u sirovom mlijeku O istra~ivanjima nazo nosti bakterije E. coli O157:H7 u mlijeku u domaoj literaturi nema podataka, ali su oni dostupni iz izvjeaa stranih autora. Vernozy-Rozand i sur. (1997) istra~ivali su u Francuskoj prisutnost bakterije E. coli O157 u razli itim uzorcima, uklju ujui i sirovo mlijeko. Bakterija E. coli O157 pritom nije ustanovljena u sirovom mlijeku. Klie i sur. (1997) istra~ivali su prisutnost verotoksi nih sojeva bakterije E.coli u uzorcima sirovog mlijeka iz 5 regija u Njema koj. Od 127 pretra~enih uzoraka sirovog mlijeka serovar bakterije E. coli O 157: H- izdvojen je iz jednog uzorka. Prema mialjenju spomenutih autora, sirovo mlijeko je potencijalni izvor infekcija ljudi enterohemoragi nim sojevima bakterije E. coli. Ansay i Kaspar (1997) navode da u 42 uzorka sirovog mlijeka u dr~avi Wisconsin nisu dokazali prisutnost bakterije E.coli O157:H7. Iz iste dr~ave potje u i suprotna izvjeaa. Naime, Padhye i Doyle (1991) su ELISA testom u 10% uzoraka sirovog mlijeka ustanovili bakteriju E. coli O157:H7. Steele i sur. (1997) izvjeauju da su iz 0,87% pretra~enih uzoraka sirovog mlijeka u dr~avi Ontario izdvojili verotoksi ne sojeve bakterije E. coli. Premda u naaem istra~ivanju nije utvrena prisutnost bakterije E. coli O157:H7, u 2 pretra~ena uzorka utvrena je nazo nost sorbitol negativnog serovara O157:H- koji se takoer smatra patogenim za ljude (Bettelheim, ). Opasnost za ljudsko zdravlje postoji ukoliko se u prehrani koriste sirovo mlijeko i proizvodi od sirovog mlijeka. Primjena higijenskih mjera u rukovanju namirnicama ~ivotinjskog podrijetla te pravilna toplinska obrada namirnica va~ne su mjere u prevenciji infekcija uzrokovanih bakterijom E. coli O157:H7 u ljudi (Doyle, 1991). VI.1.5. Salmonele u sirovom mlijeku `to se ti e nazo nosti salmonela u sirovom mlijeku, nema podataka o takvim istra~ivanjima u naaoj zemlji. No, iz brojnih izvjeaa stranih autora o ovoj problematici mo~e se naslutiti zna enje koje se pridaje istra~ivanju bakterija koje su uzro nici bolesti ljudi. Rea i sur. (1992) navode da je od 589 pretra~enih uzoraka sirovog mlijeka svega jedan (0,1%) uzorak sadr~avao salmonele. Desmasures i sur. (1997) izvjeauju o 2,9% pozitivnih uzoraka sirovog mlijeka na bakterije roda Salmonella podrijetlom s 27 farmi u Normandiji (Francuska). O~Donnel navodi da je od 1673 pretra~ena uzorka sirovog mlijeka u Engleskoj i Welsu 6 uzoraka (0,36%) dalo pozitivan rezultat na bakterije roda Salmonella. Humphrey i Hart (1988) navode da su u istra~ivanju provedenom u Velikoj Britaniji iz 6 % nepasteriziranih uzoraka mlijeka izdvojili bakterije roda Salmonella. Sharma i sur. (1995) istra~ivali su nazo nost salmonela u mesu i proizvodima od mesa peradi, smrznutoj ribi, sirovom mlijeku i sirevima. Nijedan od 300 pretra~enih uzoraka sirovog mlijeka i sira nije sadr~avao salmonele. House i sur. (1993) izdvojili su vrstu Salmonella dublin iz mlijeka, izmeta i tkiva mlije ne ~lijezde goveda. Autori smatraju da su pojedine ~ivotinje nositelji vrste S. dublin U naaem istra~ivanju, 6 (5%) uzoraka dalo je imunoenzimnim testom pozitivan rezultat. Kulturelnom pretragom na XLD podlozi niti iz jednog pretra~enog uzorka nismo izdvojili salmonele. S gotovo potpunom sigurnoau mo~emo zaklju iti da se u svim pozitivnim slu ajevima radilo o unakri~noj reakciji s antigeno srodnim bakterijama. Naime, prema navodima AOAC standarda, zbog poliklonskih protutijela koja  hvataju antigen, u izvjesnom broju slu ajeva mo~e doi do unakri~nih reakcija. Naae istra~ivanje potvrdilo je ovu injenicu. Od 6 uzoraka koji su pozitivno reagirali imunoenzimnim testom iz 2 je izdvojena bakterija roda Proteus, iz 3 uzorka E. coli, te iz jednog uzorka Pseudomonas aeruginosa. VI.2. Osjetljivost imunoenzimnih testova za salmonele i listerije VI.2.1. Osjetljivost testa TECRA Salmonella VIA `to se ti e osjetljivosti imunoenzimnih testova iz predo enih rezultata mo~e se zaklju iti da smo imunoenzimnim testom za salmonele polu ili pozitivne rezultate u onim uzorcima koji su sadr~avali najmanje 0,08 odnosno 0,06 bakterija/ml, ato u uzorku od 25 ml iznosi 2, odnosno 1,5 bakterija, ato je vrlo blizu broju od 1 bakterije/25 ml za koji proizvoa  tvrdi da ga je mogue detektirati. U viaim razrjeenjima nismo uspjeli ni imunoenzimnim testom ni kulturelno dokazati, odnosno izdvojiti salmonele. Ovdje naglaaavamo da smo u razrjeenju 1:106 bakterije S.typhimurium imunoenzimnim testom zabilje~ili pozitivan rezultat iako kulturelno nismo izdvojili salmonele. Opti ka gustoa spomenutog uzorka iznosila je 0.398 ato je neznatno viae od vrijednosti koja se smatra pozitivnom. `to se pak ti e ostalih bakterija koje smo obradili na isti na in kao salmonele, mo~emo ponoviti preporuku proizvoa a da sve pozitivne rezultate treba pretra~iti kulturelno. Naime, u ovom dijelu naaeg istra~ivanja, koriateni sojevi bakterija E. coli i Enterobacter cloacae pozitivno su reagirali imunoenzimnim testom. Opti ka gustoa pozitivnih uzoraka kontaminiranih spomenutim bakterijama bila je relativno niska (0.3-0.4) i neovisna o razrjeenju bakterije. Soj bakterije Pseudomonas aeruginosa u ovom slu aju nije pozitivno reagirao imunoenzimnim testom. VI.2.2. Osjetljivost testa TECRA Listeria VIA Imunoenzimni test za otkrivanje listerija u naaem se istra~ivanju pokazao vrlo specifi nim za listerije. U prvom dijelu naaeg istra~ivanja nismo zabilje~ili pojavu la~no pozitivnih reakcija. U drugom dijelu istra~ivanja ustanovili smo da je imunoenzimni test pozitivno reagirao u razrjeenjima u kojima je bilo 0,05 bakterija/ml za soj izdvojen iz mlijeka, odnosno 0,1 bakterija/ml za soj izdvojen iz kravljeg sira. Rezultati mikrobioloke pretrage bili su u potpunosti podudarni s imunoenzimnim testom. U viim razrjeenjima nismo zabilje~ili pozitivne rezultate imunoenzimnim testom, a i mikrobioloaka pretraga dala je negativan rezultat. VII. ZAKLJU CI: Higijenska kakvoa pretra~enih uzoraka sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka u pogledu ukupnog broja bakterija po 1 ml je nezadovoljavajua. Svega 35 % uzoraka zadovoljilo bi norme starog Pravilnika koji je dopuatao 3 x106 bakterija u 1 ml. Vrlo mali broj pretra~enih uzoraka zadovoljio bi stroge kriterije higijenske kakvoe kakvi se primjenjuju u zemljama Europske unije. S obzirom na zastupljenost pojedinih skupina i vrsta bakterija naju estalija skupina bile su koliformne bakterije ato ukazuje na vjerojatno fekalno zagaenje. Imunoenzimni test za otkrivanje listerija u naaem istra~ivanju pokazao se prikladnim kao screening test. No, zbog svega jednog pozitivnog uzorka u naaem istra~ivanju smatramo da je potrebno nastaviti istra~ivanje o prikladnosti testa za otkrivanje listerija u sirovom mlijeku. Imunoenzimni test za otkrivanje bakterije E. coli O157 treba kombinirati s dodatnim testovima za dokazivanje flagelarnog antigena H7. Imunoenzimni test za dokazivanje salmonela pokazao se osjetljivim, ali nedovoljno specifi nim. Zbog toga, prije proglaaavanja pretra~enog uzorka pozitivnim na salmonele obavezno treba kulturelnim pretragama dokazati nazo nost salmonela u uzorku. Smatramo da je za poboljaanje higijenske kakvoe mlijeka iz obiteljskih gospodarstava potrebna edukacija vlasnika ~ivotinja i muza a o higijeni mu~nje. VIII. LITERATURA Allerberger, F., J.P. Guggenbichler (1989): Listeriosis in Austria report of an outbreak in 1986. Acta Microbiologica Hungarica 36 (2-3) 149-152 Anon. (1983): Pravilnik o uvjetima u pogledu mikrobioloake ispravnosti kojima moraju udovoljavati ~ive~ne namirnice Slu~beni list SFRJ 45/1983 Anon. (1994): Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed. Williams & Wilkins. Baltimore, Philadelphia, Hong Kong, London, Munich, Sydney, Tokio Anon. (1996): A perspective on listeriosis Culturescope (1) 3-4 Anon. (1997): Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, 16th edition, AOAC INTERNATIONAL, Gaitherisburg, Maryland Ansay S.E., C.W. Kaspar (1997): Survey of retail cheeses, dairy processing environments and raw milk for Escherichia coli O157:H7 Letters in Applied Microbiology 25 (2) 131-134 Antunac, N., Jasmina Havranek, Dubravka Samard~ija (1997): Somatske stanice u kozjem mlijeku Mljekarstvo 47 (2) 123-134 Asaj, A., J. }ivkovi, Mirja Vu emilo (1974): Sanitacija vimena, stroja za mu~nju krava i staje na farmi u kooperaciji Praxis veterinaria 22 (5) 257-264 Bachman, H.P., U. Spahr (1995): The fate of potentially pathogenic bacteria in Swiss hard and semihard cheeses made from raw milk Journal of Dairy Science 78 (3) 476-483 Bettelheim, K.A. (1996): Enterohaemorrhagic E. coli a review International Food Hygiene 7: 5,7,9 Casaroti V. T., C.R. Galo, R. Camargo (1994): Occurrence of Listeria monocytogenes in raw milk, pasteurized type C milk and minas frescal cheese commercialized in Piracicaba-Sao Paulo Archivos Latinoamericanos de Nutricion 44 (3) 158-163 Cosentino, S., F. Palmas (1997): Hygienic conditions and microbial contamination in six ewes-milk-processing plants in Sardinia, Italy Journal of Food Protection 60 (3) 283-287 Desmasures N., F. Bazin, M. Gueguen (1997): Microbiological composition of raw milk from selected farms in the Camembert region of Normandy Journal of Applied Microbiology 83 (1) 53-58 Doyle, M.P. (1990): Pathogenic Escherichia coli The Lancet 336, 1111-1115 Doyle, M.P. (1991): Escherichia coli O157:H7 and its significance in foods International Journal of Food Microbiology 12 (4) 289-301 Dulin, A.M., M.J. Paape, W.D. Schultze, B.T. Weinland (1983): Effect of parity, stages of lactation and intramamary infection on concentration of somatic cells and cytoplasmic particles in goat milk Journal of Dairy Science 66 (9) 2426-2433 Farber, J.M., G.W. Sanders, S.A. Malcolm (1988): The presence of Listeria spp. in raw milk in Ontario Canadian Journal of Microbiology 34 (2) 95-100 Fenlon, D.R., J. Wilson (1989): The incidence of Listeria monocytogenes in farm bulk tanks in north-east Scotland Journal of Applied Bacteriology 66 (3) 191-196 Fenlon, D.R., J. Wilson (1989): The incidence of Listeria monocytogenes in farm bulk tanks in NE Scotland Acta Microbiologica Hungarica 36 (2-3) 255-258 Fleming, D.W., S.L. Cochi, K.L. MacDonald, J. Brondum, P.S. Hayes, B.D. Plikaytis, M.B. Holmes, A. Audurier, C.V. Broome, A.L. Reingold (1985): Pasturized milk as a vehicle of infection in an outbreak of listeriosis New England Journal of Medicine 312 (7) 404-407 Gray, M.L. (1960): Isolation of Listeria monocytogenes from oat silage Science 132: 1767-1769 Gray, M.L., A.H. Killinger (1966): Listeria monocytogenes and listeric infections Bacteriological Review 30(2)309-382 Harvey, J., A. Gilmour (1992): Occurrence of Listeria species in raw milk and dairy products produced in Northern Ireland Journal of Applied Bacteriology 72 (2) 119-125 Hayes, P.S., J.C. Feeley, L.M. Graves, G.W. Ajello, D.W. Fleming (1986): Isolation of Listeria monocytogenes from raw milk Applied & Environmental Microbiology 51 (2) 438-440 Heeschen W.H. (1998): Milk hygiene and safety in the European and international markets Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 50 (1) 53-77 House, J.K., B.P. Smith, G.W. Dilling, L. Daroden (1993): Enzyme-linked immunosorbent assay for serologic detection of Salmonella dublin carriers on a large dairy American Journal of Veterinary Research 54 (9) 1391-1399 Humphrey, T.J., R.J. Hart (1988): Campylobacter and Salmonella contamination of unpasteurized cow~s milk on sale to the public Journal of Applied Bacteriology 65 (6) 463-467 Husu, J.R. (1990): Epidemiological studies on the occurrence of Listeria monocytogenes in the feces of dairy cattle Zentralblatt Fr Veterinarmedizin 37(4)276-282 Husu, J.R., J.T. Seppanen, S.K. Sivela, A.L. Rauramaa(1990): Contamination of raw milk by Listeria monocytogenes on dairy farms Zentralblatt Fr Veterinarmedizin 37(4)268-275 Jensen, E.N., F.M. Aarestrup, J. Jensen, H.C. Wegener (1996): Listeria monocytogenes in bovine mastitis. Possible implication for human health International Journal of Food Microbiology 32, 209-216 Klie, H., M. Timm, H. Richter, P. Gallien, K.W. Perlberg, H. Steinruck (1997): Detection and occurrence of verotoxin-forming and/or shigatoxin producing Escherichia coli (VTEC and/or STEC in milk) Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift 110 (9) 337-341 Klinger I., I. Rosenthal (1997): Public health and the safety of milk and milk products from sheep and goats Revue Scientifique et Technique 16 (2) 482-488 Maji, T., M. Had~iosmanovi, I. Karadjole, }. Cvrtila (1998): Sastav i kakvoa kozjeg mlijeka iz obiteljskih gospodarstava Zbornik radova Veterinrski dani 98, 75-79 Margolles,A., A. Rodriguez, C.G. Delosreyesgavilan (1996): Some chemical and bacteriological characteristic of regional cheeses from Asturias, Spain Journal of Food Protection 59 (5) 509-515 Massa S., D. Cesaroni, G. Poda, L.D. Trovatelli (1990): The incidence of Listeria spp. in soft cheeses, butter and raw milk in the province of Bologna Journal of Applied Bacteriology 68 (2) 153-156 Matthews, K.R., P.A. Murdough, A.J. Bramley (1997): Invasion of bovine epithelial cells by vericytotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 Journal of Applied Microbiology 82 (2) 197-203 Montenegro, M. A. (1990): Pathogenic Escherichia coli Journal of Clinical Microbiology 28 (6) 1417-1421 Moura S.M., M.T. Destro, B.D. Franco (1993): Incidence of Listeria species in raw and pasteurized milk produced in Sao Paulo International Journal of Food Microbiology 19 (3) 229-237 O~Donnel, E.T. (1995): The incidence of Salmonelle and Listeria in raw milk from farm bulk tanks in England and Wales Journal of the Society of Dairy Technology 48 (1) 25-29 Padhye N. V., M.P. Doyle (1991): Rapid procedure for detecting enterohemorrhagic Escerichia coli O157:H7 in food Applied and Environmental Microbiology 57 (9) 2693-2698 Park, Y.W., R.D. Humphrey (1986): Bacterial cell counts in goat milk and their relationships with somatic cell counts, percent fat, protein Journal of Dairy Science 69 (1) 32-37 Poutrell, B., C. Lerrondelle (1983):Cell content of goat milk: California Mastitis Test, Coulter Counter and Fossomatic for predicting half infection Journal of Dairy Science 66 (9) 2575-2579 Quinn, P.J., M.E. Carter, B.K. Markey, G.R. Carter (1994): Clinical veterinary microbiology, Wolfe, London, 226-236 Rabold, K., A. Hermann, H. Grimm (1990):Zum Einfluss von Melkverfahren auf die Mastitissituation in Problembetrieben Wiener Tierrtzliche Monatsschrift 77 (2) 55-58 Rea M.C., T.M. Cogan, S. Tobin (1992): Incidence of pathogenic bacteria in raw milk in Ireland Journal of Applied Bacteriology 73 (4) 331-336 Rea, M.C., T.M. Cogan, S.Tobin (1992): Incidence of pathogenic bacteria in raw milk in Ireland Journal of Applied Microbiology 73 (4) 331-336 Reilly W.J., J.C. Sharp, G.I. Forbes, G.M. Paterson (1983): Milkborne salmonellosis in Scotland 1980 to 1982 Veterinary Record 112 (25) 578-580 Richwald, G.A., S. Grenland, B.J. Johnson, J.M. Friedland, E.J. Goldstein, D.T. Plichta (1998): Assesments of the excess risk of Salmonella dublin infection associated with the use of certified raw milk Public Health Reports 103 (5) 489-493 Sanaa, M., B. Poutrel, J.L. Menard, F. Serieys (1993): Risk factors associated with contamination of raw milk by Listeria monocytogenes in dairy farms Journal of Dairy Science 76(10)2891-2898 Schwarzkopf, A. (1996): Listeria monocytogenes-aspects of pathogenicity Pathologie Biologie 44 (9) 769-774 Sharma, V.D., V.P. Dixit, R.K. Joshi (1995): Occurrence of Samonella serovars in foods of animal origin with special reference to antibiogram and enterotoxigenicity Journal of Food Science & Technology 32 (3) 221-223 Steele, M.L., W.B. Mcnab, C. Poppe, M.W. Griffits, S. Chen, S.A. Degrandis, L.C. Fruhner, C.A. Larkin, J.A. Lynch, J.A. Odomeru (1997): Survey of Ontario bulk tank raw milk for food-borne pathogens Journal of Food Protection 60 (11) 1341-1346 Suarez, B., C.M. Ferreiros (1991): Psychrotropic flora of raw milk: resistence to several common disinfectants Journal of Dairy Research 58 (1) 127-136 Takai, S., F. Orii, K. Yasuda, S. Inoue, S. Tsubaki (1990): Isolation of Listeria monocytogenes from raw milk and its environment at dairy farms in Japan Microbiology & Immunology 34 (7) 631-634 Vernozy-Rozand C., C. Mazuy, S. Ray-Gueniot, S. Boutrand-Loei, A. Meyrand, Y. Richard (1997): Detection of Escherichia coli O157 in French food samples using an immunomagnetic separation method and the VIDAS E. coli O157 Letters in Applied Microbiology 25 (6) 442-446 Wilson, D.J., N.S. Keith, M.S. Philip (1995): Effects of stage of lactation, production, parity and season on somatic cell counts in infected and uninfected dairy goats Small Ruminant Research 16, 165-169 Yoshida T., M. Sato, K. Hirai (1998):Prevalence of Listeria species in raw milk from farm bulk tanks in Nagano prefecture Journal of Veterinary Medical Science 60 (3) 311-314 }ivkovi, J., A.Asaj (1973): U inak dezinfekcije vimena na poboljaanje higijenske kvalitete mlijeka Praxis veterinaria 21 (1-2) 19-26 }ivkovi, J., A.Asaj, Mirja Vu emilo (1974): Poboljaanje higijenske kvalitete mlijeka nakon eksperimentalne upotrebe  Kiselog sredstva i Halamida za iaenje i dezinfekciju mljekovoda Praxis veterinaria 22 (1-2) 23-26 SA}ETAK U radu je istra~ena higijenska kakvoa skupnih uzoraka sirovog kozjeg i ov jeg mlijeka podrijetlom iz obiteljskih gospodarstava. Ukupno 115 uzoraka kozjeg i 15 uzoraka ov jeg mlijeka pretra~eno je standardnim laboratorijskim pretragama s obzirom na: ukupni broj bakterija i prisutnost pojedinih rodova i vrsta bakterija, a primjenom komercijalnih imunoenzimnih testova uzorci su pretra~eni s obzirom na nazo nost listerija, salmonela te bakterije E. coli, serovar O157. U drugom dijelu rada istra~ena je osjetljivost imunoenzimnih testova za listerije i salmonele pomou umjetno kontaminiranih uzoraka. U usporedbi s Pravilnikom iz 1983. 42 (35 %) uzoraka zadovoljilo bi norme spomenutog Pravilnika (3x106 bakterija/ml), a svega 10 uzoraka (8,3 %) zadovoljilo bi stroge propise Europske unije (105 bakterija/ml). S obzirom na zastupljenost pojedinih skupina i vrsta bakterija, naj eae je izdvojena skupina koliformnih bakterija (91,6 %), a potom slijede mikrokoki (63,3 %), enterokoki (50,8 %), S.aureus (26,6 %), hemoliti na E.coli (15,8 %), streptokoki seroloakih skupina C i E (9,1 %), Psedomonas aeruginosa (9,1 %), Bacillus spp. (4,1 %), Proteus spp. (1,6 %), Serratia marcescens (1,6 %) te Streptococcus agalactiae (0,8 %). Iz jednog pretra~enog uzorka sirovog mlijeka (0,8 %) koji je pozitivno reagirao u imunoenzimnom testu, izdvojen je hemoliti ni soj listerije. Iz dva uzorka koja su pozitivno reagirala u testu za bakteriju E. coli O157 izdvojeni su sorbitol negativni sojevi bakterije E. coli koji nisu sadr~avali flagelarni antigen H7. U imunoenzimnom testu za salmonele pozitivno je reagiralo 5 uzoraka. Kulturelnom pretragom pozitivnih uzoraka salmonele nisu izdvojene. Iz 2 uzorka izdvojena je bakterija E. coli, iz 2 Proteus sp. te iz jednog uzorka Pseudomonas aeruginosa. S obzirom na osjetljivost, imunoenzimni test za salmonele pozitivno je reagirao s uzorcima koji su sadr~avali 1,5 bakterijske stanice/25 ml mlijeka (S. typhimurium), odnosno 2 bakterijske stanice/25 ml mlijeka (S. enteritidis). Imunoenzimni test pozitivno je reagirao i s bakterijama E. coli i Enterobacter cloacae, dok je s bakterijom Pseudomonas aeruginosa dao negativan rezultat. Imunoenzimni test za listerije pozitivno je regirao s uzorcima mlijeka koji su sadr~avali : 2,5 bakterijskih stanica/25 ml mlijeka, odnosno : 1,25 bakterijskih stanica/25 ml mlijeka. Zavod za mikrobiologiju i zarazne bolesti Veterinarskog fakulteta Sveu iliata u Zagrebu Zagreb, 4. studenog 1999. Predmet: Ocjena magistarskog rada Miroslava Benia F A K U L T E T S K O V I J E  E Veterinarskog fakulteta u Zagrebu Obavjeatavam Vas da je Miroslav Beni, dipl. veterinar, polaznik znanstvenog poslijediplomskog studija Mikrobiologija i epizootiologija izradio i predao na ocjenu magistarski rad: Nalazi bakterija u skupnim uzorcima mlijeka koza i ovaca podrijetlom iz obiteljskih gospodarstava. Molim Naslov da izabere povjerenstvo za ocjenu magistarskog rada. U Povjerenstvo za ocjenu predla~em: Prof. dr. sc. Josip Madi Prof. dr. sc. T. Nagli Dr. sc. Stjepan Topolko, Prof. dr. sc. T. Nagli, voditelj poslijediplomskog studija i mentor pristupnika ----------------------------------------------------- Potovani kolega, Danas (1. prosinca) ili sutra ce Vam Institut poslati E-mail-om magisterij. Neka moja objasnjenja napisana su na pocetku magisterija, a dodatna vam saljem ovim E-mailom. Dakle, molim Vas da u tom primjerku magisterija oznacite tocno mjesto na kojem cete naciniti bilo kakve dopune ili promjene tog rukopisa. To je jako vazno, jer cu ja taj rukopis jos obradjivati. I kad se vratite, to ce nam olaksat stvaranje konacne verzije. Neke promjene u tablicama bi morale slijediti odgovarajuce promjene u grafovima Takodjer nastojte sami prevesti Sazetak na engleski i zamolit nekog Engleza da ga ispravi. Na Vijecu su nam Naslov izmijenili tako da su ispustili iz obiteljskih gospodarstava, jer da i onako nije jasno sto su to obiteljska gospodarstva. Takodjer vas jos jednom molim da mi u dogovoru s ravnateljem javite kada biste htjeli braniti magisterij. Mozda ce biti najbolje da me nakon vaseg razgovora s njime o tome on nazove. Puno srdacnih pozdrava prof. Naglic  EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s   EMBED MSGraph.Chart.8 \s  VX  <LNLZ *\j|Z~ !Z!!"L""\#p###&$`$$n%%&&&&^'''((z)))*Z,L-d/t/0061`111"2ɽ6CJ6mH56CJ5mH 6CJmHCJmH 5CJmHmHCJ CJOJQJ 6OJQJ 5OJQJOJQJJTxz|f h 8RTV$dhTxz|f h 8RTV*`f&Z~ !Z!!L""""#&$`$$ſٶ  t       ?*`f&Z~ !$dh$dh$dh$dh $dh$dh$dh!Z!!L""""#&$`$$$n%&&&^'''$(()z)).*$dh$$dh$dh$dh$dh$dh$dh$$n%&&&^'''$(()z)).*t***++Z,,L-h---.3@3B3D3F3H3J3L3n3p3r3t3v3x3z3|3½k:  F.*t***++Z,,L-h---.3@3B3D3F3H3J3L3n3p3r3t3v3x3$"2^2>3333333\:b:r<<<:===:C@BDEQUY[]_aceghuy} a "ԁ #.EQhuςՂւ  N&F2V^ė̙(6^̤PbʮDdȳBķط$.J &,HL^6CJ 56CJ5CJCJ 56mH6mH5mH 6CJmHCJmHmH 6CJmHCJmHO<$$$d$$$R$$l04rOU" ԁ܁|||wwwwwww$$$$~$$l4 OU"   "#wrrrmmmmmmmw$$$$$$l O U" #.268:<>@BDEQm$$l O U"$$$$ QUY[]_aceghuym$$l O U"$$$$ y}m$$l O U"$$$$ rmmm$$$$l O U"$$ ÂƂȂʂ̂΂ς NP҅օ,ćX\^ėƗ>@@jܛޛ^`ȮʮBDd@Bh|~~&(stu  SÂƂȂʂ̂΂ς Nrliii$$d$$l O U"$$ NP҅օ,ćX\^ėƗ>@@jܛޛ^`$$h`ȮʮBDd@Bh|~~$dh$hdh$h$~&(,24 DJ"<XZlprJR,@bp HNjprtv.06ż66CJCJCJmHjCJUmHmH jUmHCJmH CJH*mHjCJUmH CJH*mHCJmH5 5CJmH5CJmHCJD~&(*,<Nl$$$ & F$dh$$$dh$dh$*,<Nl DFHJ"$&(*,.02468:<|yvspjg '=>?@[\]  `  c  f  i  k  m  z{               c' x$$f$$l?֞ ypg^U" DFHJ"$&(*,.0246$f$$l֞ ypg^U"68:< >@JPVX^djl0(<$$TlXF8$$$ & F$ >@JPVX^djlnpJLNPR ${wrmid      %&  *  ?@  G  \]fghi  l  o  rs  v  y  ~      %lnpJLNPR h8/$$l09B$$$$$dh$dh$dh$ $*,@FHrxz<8ddXHD` $$$$/$$l09B$*,@FHrxzHLNjnprvxz|~}zupkfa\^_`abcefg  i  wx  z                               "HLNjnprvxz|~D$dh$$$/$$l09B$$ $$.0246"$&6bx"Ŀyrkd]YR      #  %  )  +  9:  L  b  m      UVWXYZ[\].0246"$&6bx|E$$lX\<" $dh$$$dh6$04F\vjpr~,(Z>\c.           b x    ~     4 @ CJ 5CJmH CJmH CJmH5CJ jUmHmHH*mHH*66CJCJR"&.4<DFfjrv~|$$[$$lXֈ< " $dh$"&.4<DFfjrv~Ľ~ytoje`[VQ                       $$$dh$dhvx j8pV:2jrtvſ๳yqid_7  m          Ipc k   $vx j8pV:2j $ & Fdh$hdh$$dh$hdh$dh$dh$dh$$jrtvxz|~,6VXZ$dh$ & F $ & Fdh$hdh$dh$dh $ & Fdhvxz|~,6VXZ>@4  >?~{vsnid`9  W  j  |} >78-   E        =   c #>@4  >?U`:$$lFOf$$$$$dh$dh$dh?U.         ` b   | ~     @ |            ~zwtqnkheb_23456789:;  d            6  ^  qr          ;  OP          "  8%U.         ` b   | ~    D8@:$$lFOf$$  @ |                 d$dh$$$$:$$lFOf@ |  ^&8hlVRBJtz"!r!$$:''''':+b+-.*/B/`2t2~33Z44H555h9l99z;~;;>>?~DDDE.F4G6GG6M:MMMNNN6[8[[[] ^^(^8^F^^^^^~__r`~`56CJmH5mH5mH 6CJmHCJmH 5CJmHCJCJU      VXPRTRTXZBDHJtvxz"ձy      Z[\ ],-./01,VXPRTRTXZ$$$$dh$dh$dhBDHJtvxz"!!!p!r!!!"z"""$hdh $ & F dh$$dh$dh$$!!!p!r!!!"z""""# #n#####F$$$2%f%%&:&d&&6'8':'''''6+8+:+yvspm/0 Z   :a>P^s.Bii    \  )""# #n#####F$$$2%f%%&:&d&&6'8':'''''6+8+$$dh$dh$dh8+:+b+d+-----..*/,/./B/D/\2^2`2t2v2z3|3~333R4$dh$dh$dh$dh:+b+d+-----..*/,/./B/D/\2^2`2t2v2z3|3~333R4T4V4X4Z444F5H555h9j9l999z;|;Ǹ}wtqn o tu frs hi    8 *R4T4V4X4Z444F5H555h9j9l999z;|;~;;;>>? ???@$$dh$dh$dh|;~;;;>>? ???@@B~DDDDDEEE.F2F4G6GGG6M8M:MMM|N~NNNNOPQ^RRBST*V,VfV𮫥ޖ~{xu^vU7Z _  Y 2OP )*^|} W f.@@B~DDDDDEEE.F2F4G6GGG6M8M:MMM|N~NNNNO$dh$dh$dhOPQ^RRBST*V,VfVWW&XXfY Z8[[[b]d]f]h]j]l]n]p]r]$dh$dh$dhfVWW&XXfY Z8[[[b]d]f]h]j]l]n]p]r]t]v]x]z]|]~]]]]]]]]]]^^`cccdd g"g$g|wtqUV U-. ^$},r]t]v]x]z]|]~]]]]]]]]]]^^`cccdd g"g$g$dh$dh$dh$dh~```bbcccd ggg.h@BDFHJLNPRTVXZ\^*,dfh |yvs{|}        ,\^`bd02468:<>@BDFHJLNPRTVXZ$$dhZ\^*,dfh  :<>@BDFHJL h$ & F$$$$dh$dh$  :<>@BDFHJL hƵе޵ %34}xsnie<  J  P  ]  b  n  r  t  w  {                ;  _  opn)*%h*.JNfjе4C2@lr^b.4Z^z~:<4LPR!#,55CJH*mHCJmH6CJCJ CJH*mH 6CJmH 5CJmHCJmH6 6CJmH CJH*mHCJmHKƵе޵ Ôt<$$l4FF#$$<$$l4FF#%34CJOSVXi{}p}L|$$l F Bh#$$4CJOSVXi{Ѷ 012@EIĿ}xsnje`[  *  /  =>  ?  P  b  s  w  z  ~                                    %  ,  ;!Ѷ}<x$$|$$l F Bh#$$  012@EINSYe}(|$$l F Bh#$$INSYelyz{|}~^`bl.024":<l||wrmhc              5  6  78  u                  !  &%elyz{|}~}zzzzzttt$dh$|$$l F Bh#$$ ^`bl.024":<$$l4FF#$ & F$$$$$$dh:<l|ì$$<$$l4FF# <JV`hnrĿ|wrmhc^              $  *  1  FG  [  m  }    #<JV`hnrwrrrrrrrrrrw$$$$l F 9{] #   $dh$$  46LNPR#./<>@CFILMĿ|wrmhc_]  `  c  f  i  k  m  z{               cstu $46LNPR#.$$$ & F$dh$$$dh,-MNOPil<J:PfvL\lzXjکککH*6CJ55CJ66CJCJ 5CJmHCJmHjCJUmHmH jUmHCJCJmH CJH*mHjCJUmHmHCJmH CJH*mHB./<>@CFILx$$f$$l?֞ ypg^U"LMNijkl$f$$l֞ ypg^U"MNijkl{xupmjfghi  l  o  rs  v  y  ~       '=>?@[\)0(<$$TlXF8$$$ & F$<JLv~h8/$$l09B$$$$$dh$dh$dh$<JLv~28:^df}xtojfa\                                 %&  *  ?@  G  \]$28:^df<8ddXHD` $$$$/$$l09B   {vqle^W      UVWXYZ[\]^_`abcefg  i  wx  z   !  D$dh$$$/$$l09B$$ $$ 2VXtx|E$$lX\<" $dh$$$dh2VXtx (*.Ľ}voha]XSN                            #  %  )  +  9:  L  b  m |$$[$$lXֈ< " $dh$(*,0246NPRv~  (7Ra|#/89e&,06:@DJNTX^bhlrv| 6CJmH CJH*mHCJmHCJCJmH5CJ jUmHmHH*mHT(*.0248:<>@BDFHJLNRTVXZ\^`bd$dh$dh.0248:<>@BDFHJLNRTVXZ\^`bdfhjlnprtvĿ}zupkfs~&dfhjlnprtv|~$$$$dh$dh$dh|~  !"#$%&'(79½}xsnie`[                                                            &'r" C`$$Tl548d s #1@!$$$ !"#$%&'$$ '(79;=?AHCCCCCC$$$$TlE48d s #1@!$ 9;=?ACEGIKMOQRacegikmoqsuwy{|ÿ~yupkfa\W  L  N  P  R  T  ij  l  n  p  r  t  v  x  z  |  ~                                "ACEGIKMOQ$$QRacegikIDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$kmoqsuwy{$${|IDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$Ŀzupkfa\W                      !  "  #  $  %  &  '  (  )  +  -  /  1  9:  <  >  @  B  D  F  H  J"$$IhDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$$$IDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$$$   "#9;=?ACEGIKMOQSĿzupkfa\W                                                                "  IDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$ "$$"#9;=?ACIDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$CEGIKMOQS$$STUVWXYZ[\]^_`abcde",6@JT^hr|¿~yupkf  k  l  vw  }                           &STUVWXYZ[IFFFFFFF$$$Tl8d s #1@!$[\]^_`abcde",6@JT^hr|$$$ & F$&Dz :pr\\jPd *:$ l^  \l\  drvP" # 56mH6CJCJ6mH5mHmH 6CJmH CJH*mHCJmHUH`CCCCCC$$$$Tl548d s #1@!$  $&DHLPTX\Ŀ~zupkfa\W        !  #  %  45  7  9  ;  =  ?  A  C  E  G  I  K  M  O  ^_  `  a  b  c  d  e  f  g  h  i  j"$$HCCCCCC$$$$TlE48d s #1@!$   $$$$&DHLPTXIDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$X\`dhlptx$$\`dhlptxz Ŀzupkfa\W                                                                 "xzIDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$$$IDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$ $$ :>BFJNRVZ^bfjnpĿzupkfa\X\  ^  `  b  d  f  h  j  l  n  p  r  t  v                                    " :>BFJNIDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$NRVZ^bfjn$$npIDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$$$ IDDDDDD$$$$Tl8d s #1@!$  $(,048:<>@BDFHJLNPRTVXZ\^`bdfhjlþ|yvspmj !"#$%&'()*+  -  /  1  3  5  7  9  ;  =  ?  A  C  E  [( $(,048$$8:<>@BDFHIFFFFFFF$$$Tl8d s #1@!$HJLNPRTVXZ\^`bdfhjlnprxz|~$$lnprxz|~Z\Ŀ~ytoje`[   "Z\VXZ\ $$$\VXZ\ fhjl \vLNP)000 0"00Ŀ~ytoje`[vw DE@A! fhjl \vLNP)000 0$dh$h$hdh$$ #$$2&F&(()))n/|////0"00166686>:L:V::H<v<=D=n=p=CCpCCzE|EKKZOO%PPPRS|SS#T0ToT}TTTTUU~VWWIXkXY(YyYYZZG[y[d\x\\CJH*5CJH*mH56CJmH 5CJmH 6CJmH CJH*mHCJmH 56mH5mH6mHmH6CJCJJ 0"00011====n=p=CCCCC C"C$C&C(C*C,C.C0C2C4C6C$dh$$0011====n=p=CCCCC C"C$C&C(C*C,C.C0C2C4C6C8C:CC@CBCDCFCHCþ}xsnid_$%&'()*+,-./0123456789:;<CDEF89lm#6C8C:CC@CBCDCFCHCJCLCNCPCRCTCVCXCZC\C^C`CbCdCfChCjClCnCpC$HCJCLCNCPCRCTCVCXCZC\C^C`CbCdCfChCjClCnCpCCF>HJKNZO\O^O`OĿ|rh^YTO    n    [     !"#pCCF>HJKNZO\O^O`ObOdOfOhOjOlOnOpOrOtOvOxOzO|O~OOOO$$ & F$`ObOdOfOhOjOlOnOpOrOtOvOxOzO|O~OOOOOOOOOOOOOOOOOOOĿ~ytoje`[     !OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO$OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOPPRR"T#ToTpTTTUUWWĿ~ytoje`[|  WXKL!OOOOOOPPRR"T#ToTpTTTUUWWIXJXYYyYzYZZG[$$WIXJXYYyYzYZZG[H[d\e\\\s]t]^^o_p_5`6`aa:b;bbb:c;c d ddĿ~ytoje`[ϳгZ[ϴд Զնxy:;»û{!G[H[d\e\\\s]t]^^o_p_5`6`aa:b;bbb:c;c d dddeeff$\\s]]^^o__5`X`aa:bMbbb:c]c dWdddeef*ffFgHh^hiHiijjkRlvl mn~ooppqq@rQrrr'sXsst t(tuuvvxwwWxxxyyypzz {c{{9||7}}}^~~~~`7yvi;:26CJCJ5CJ`ddeeffHhIhiiiijjjjRlSl m m~ooppqqrr's(sssuuĿ~ytoje`[2֦צ`a;<_`>?JKLM23¯<=!fHhIhiiiijjjjRlSl m m~ooppqqrr's(sssuuv$uvvxwywWxXxxxyypzqz {!{{{||}}^~_~`a78vwiĿ~ytoje`[͙Ι'(01rs./no1!vvxwywWxXxxxyypzqz {!{{{||}}^~_~`a78$vwij;<24"$&(*:<ȝʝ |~$dh$$$ij;<24"$&(*:<ȝʝ |~ f5HJ~¿|t       !E !;<jM5678/0ɕʕ-2:2@xzJL L\ܒ 2R`ʓvp~ܘ 1?uȚϚԚȝʝ̝ !"$%?@ABDE_Ŀ jUj_: UVmH jUj.`: UVmHjc: UVmH jUOJQJOJQJ CJH*mH 6CJmHCJmHCJ5CJD f5HJ~է֧$ $ & Fdh$dhէ֧#$CDcdèĨ#$CDcd&#$CDcdèĨ#$CDcd_`abde¨ĨŨߨ !"$%?@ABDE_`abdeþ j4KU j&CU jAUj_: UVmH j8Uj.`: UVmH j2Ujc: UVmH j *Uj: UVmH j6!Uj: UVmH j_Uj": UVmH jU jQUj_: UVmH5eOJQJ j\Uj: UVmH jU j TUj: UVmH $. A!"#$%5 0. A!"#$% P0 0. A!"#$%5 0. A!"#$% P0$PPx. A!"#$%`!FH>G/AyA\dd xQNA};;! FBL$hB \1~Aj#3sD&ٛ7o罽q94{Ò,W0f^32cS!CgxEx oha]57dxduhCfG ^D_VCo%>|BM3'awj+UHtnq[fލrtwAwXĿnf8ELyFsg M7VDd `<  C A? 2Zv55@W虠W6aZ`!.v55@W虠WZ,XPv<xY]hU>f2["HcV<$1*BՒ m >$M-RP> y<>(ZJP% -TZXϹwY7;Rp2~sϽ3{w,8|I,5R bp Ғbh!mğRŽғ=m$>FA{unҙ&}uq5LJoTw6H<~˜@!ro):60]Qs[1ǭE㭅9x ⠯k~G<.=FgZylẙQ䶞oyyxc޸mf]l*v=!w5WA|b$+=i]nkXXѴh caW^6szX븱+gE۟=4ʟ#3NrN&ݝLlYMɲ ZmjEViUMU.^,vC4ޖhy[ºM]شP.`L*T?Z+zgOeuS;b֣x ¯e}!j*jWwijKVK(&pw^[)ۛ3kđ5Ȟ"ጎ.]u8$s93C=Yg쟏Z򟚃QN}N|ygf0wRW 杊; ֟Cȸߎ|f{2 a?X|{.6ؐTD~erS=gV2Ư`P 8a\)G'xIcA*5[qn"ȹnIԘ;l` iS0s[!_V /fTS6C4גʿh#k*E3 b^aH{mΙ<>{r=:9;ޓyڱOqC=73y{5;I>'zg Dd ]<  C A? 2~FI GNZ`!RFI GNH$8O9 xŘ PUeE2bV[m;nZ#n :J*889:MC ,4\&F(@ii{ jsޏ}9^"Z0$PD]%;#6Nyۺ~+gV'Zƈm nX E)*o4}6f3'uƔ$4z M,2=u_b:lv]7IKKCo[U\.8A͵i̳4u7Zul5{Ô7('B '*} 77wh3L ZshRM'qQ#~GKmD;HAWrSS<8g\mcHQ$A<>G Y2Q&}i4hXWF_K_};~;;~ƞ_JuϫF}]o5[c5&xɆ!}Rh1!P" cGGR+>&G$bMĉ)WHƵ-:ů9O<@,=')%%%%Лo57I%b(D؏(K$JqZ|o/vO5•j;_Lz>v!~kSvZyҼ4ٗ]x_a䁧"n=v] ھ}!ڂ1p-/mŪiTz Lgݱ{vΎ={nX hblYɉScgņZ׫fEkkK]/?Ceң큮LGPiGBvFf6/Fl/j<抎Q]߿QYsT|YDd@ <  C A? 2g;%xOkt`!g;%xOkt )kxcdd```9`,F  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$+<c=/0123456789:;C>?@ABY`EFGHIJKLMNOPQRSTUVWXZ[\]^_abdhefgklmnopqrstuvwxyz{|}~Root Entry/ F@-"@E7;-PData eWordDocument.!8ObjectPool1@f7;@E7;_979630587"FI7;I7;Ole PRINT.tCompObjb  !"#$%&'()*+,-./014789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghklmnopruvwxyz{|}~ FMicrosoft Graph 97GBiff5MSGraph.Chart.89q  AB""Kn"\ #,##0;\-"Kn"\ #,##0#"Kn"\ #,##0;[Red]\-"Kn"\ #,##0$"Kn"\ #,##0.00;\-"Kn"\ #,##0.00)$"Kn"\ #,##0.00;[Red]\-"Kn"\ #,##0.00>*9_-"Kn"\ * #,##0_-;\-"Kn"\ * #,##0_-;_-"Kn"\ * "-"_-;_-@_-w9* 5 ]   ( ''  "Arial---}"Arial-----------------------------------------------------"System-'- ( -'- ( -'-  s - "-  $60  66- $6T,6$,0 ,0  "-60 ;0 @0 E0 J""0 O''0 T,,0  -$0  660  "-$6T,6$,0 ,0  "-MM - MMMM$6^6 - $>6>6>6-ss - ssss$^t^>"Arial--- "- - -'---ss ssu   2 7A-- - -'---  s "- MM - MMMM $c6cc6 - $6cc66-ss - ssss$cc--- - -'--- ss ss&b^   2 }3A-- - -'---   s "- MM -  MMMM $6!|!6 -  $O6O6O6-ss - ssss$!||O--- - -'---ss ss e   2 7w16AA-- - -'---  s "- MM - MMMM $t 6t  | t 6 - $6t t 66-ss - ssss$t  | |t --- - -'--- ss ss    2 716AA-- - -'---   s "- MM -  MMMM $ 6 s2 J2  6 -  $_ 6_ s s 6_ 6-ss - ssss$ s2 J J_ s s--- - -'---ss ss u    2  18AA-- - -'---  s "- MM - MMMM $ 6 T ,  6 - $ 6 T T 6 6-ss - ssss$ T , , T T--- - -'--- ss ss     2  60AA-- - -'---   s --  "-6 T66;;@@EEJJOOTT- 2 N0I 2 10II 2 20II 2 30II 2 40II 2 50II 2 60II------- -'-- 7Td 2 s@broj A'A! 2 v domainsta 2 eva9A-- -'--  s 6 6 6T6QTQ6T6aTa6 T 6r Tr 6 T ----- -'-- I C ]2 U9 1 2 3 4 5 6!A!!!!!!!!!!A!!!!!!!!!!!A!!!!!!!!!!A!!!!!!!!!A!!!!!!!!!!A-- -'--  s - -'-- ( --- -'--  S 2 r-Graikon 1. Razdioba domainstava prema UBB/ml-- -'-- ( - -'-- ( - ' (  '  'ObjInfo WorkbookP _979382012 FI7;7;Ole 2,)'_-* #,##0_-;\-* #,##0_-;_-* "-"_-;_-@_-F,A_-"Kn"\ * #,##0.00_-;\-"Kn"\ * #,##0.00_-;_-"Kn"\ * "-"??_-;_-@_-4+/_-* #,##0.00_-;\-* #,##0.00_-;_-* "-"??_-;_-@_-1Arial1Arial1Arial1Arial1Arial1;Arial1Arial1;Arial1Arial=#,##0.00_  A` ` ` J ` ` J 883ffff̙̙3f3fff3f3f33333f33333\R3& STU@@0@0@2@N@WY(#= &/>X483d 3QQQQ3_4E4D $% M 3O&Q4$% M 3O&Q4FANC 3ONC 3 bo#M!  O43*#M! M! M NM4% ( <M3O&Q v9 1 2 3 4 5 6'4% bM3OM<&Q &broj domainstava'43" :dd3_ M NM  MMd 444% O <M03O@&Q ^-Graikon 1. Razdioba domainstava prema UBB/ml'4% MP3O&Q'44  FMicrosoft Graph 97GBiff5MSGraph.Chart.89q  AB""Kn"\ #,##0;\-"Kn"\ #,##0#"Kn"\ #,##0;[Red]\-"Kn"\ #,##0$"Kn"\ #,##0.00PRINT D$(CompObj3bObjInfo 5Workbook6 85)       a ''  "Arial-----"System-'-  a -'-  a -'-  A "-- 7 7,M3 - "-M3 - M3M3$  *3f - 3f$ppp\\II55!!ttaaNNN;;))vveeTTDDD33##}}~y~ypvpvpvcrcrVnVnIjIj=f=f0b0b$^$^ZZ V V VRRNNIIEEAA<<88833..**%%!!~ ~ x x rrmmggbbb^^YYVVRROOLLIIGGGEEDDBBAAAAAAAAAAABBDDEEGGIILLLOOR{R{VvVvYqYq^l^lbgbggcgcm^m^m^rYrYxTxT~O~OJJEEAA<<<7733..))%%      $$000==IIVVccpp~~##33DDTTeevvv));;NNaattt!!55II\\pp!!!55II\\pp  ..@@@SSeeww##444DDTTccss    MM - MMMM$                                   % % % * * * / / / 4 4 4 9 9 > > > C C C G G G L L L Q Q Q V V V [ [ [ _ _ _ d d d h h h m m r r r v v v { { {~ ~ ~ t t t i i i ^ ^ ^ S S S H H H < < < 0 0 $ $ $                                 } } } m m m ^ ^ ^ N N N > > > - - -                              o o o ] ] ] J J J 8 8 % % %       zzzf f S S S ? ? ? + + +      DDDDD+C+C+C?C?C?CSBSBSBfAfAz@z@z@???>>>===<<<;;;999 8 8 8 6 6 6% 5% 5% 58 38 3J 1J 1J 1] /] /] /o -o -o - + + + ) ) ) ' ' ' % % % # # #              - - - > > > N N N ^ ^ ^ m m m } } }                                 $ $ $ 0 0 < < < H H H S S S ^ ^ ^ i i i t t t ~ ~ ~                                     { { { v v v q q l l l g g g b b b ] ] ] X X X S S S N N N I I I D D D ? ? ? : : 5 5 5 0 0 0 * * * % % %   MM -$ D  - $} , ,$ 0$ 0$ 00 40 40 4< 8< 8< 8H <H <H <S @S @S @^ E^ E^ Ei Ii Ii It Mt Mt M~ R~ R~ R V V V Z Z Z _ _ _ c c c h h h m m m q q q v v v { { {                                                                                                    % % % * * * / / / 4 4 4 9 9 9 > > > C C C G G G L L L Q Q Q V V V [ [ [ _ _ _ d d d h h h m m m r r r v v v { { {~ ~ ~ t t t i i i ^ ^ ^ S S S H H H < < < 0 0 0 $ $ $                                  } } } m m m ^ ^ ^ N N N > > > - - -                               o o o ] ] ] J J J 8 8 8 % % %       zzzf f f S S S ? ? ? + + +       ,M3 - M3M3$pp\\\III55!!!tttaaaNN;;;)))vveeeTTTDD333###}}}~y~y~ypvpvcrcrcrVnVnVnIjIj=f=f=f0b0b0b$^$^ZZZ V V VRRNNNIIIEEAAA<<<88333...**%%%!!!~ ~ x x x rrrmmgggbbb^^YYYVVVRROOOLLLIIGGGEEEDDBBBAAAAAAAAAAAAAABBBDDEEEGGGI I LLLOOORRVVVY#Y#Y#^(^(b-b-b-g2g2g2m7m7r<r<r<xAxAxA~E~EJJJOOOTTYYY]]]bbfffkkkpptttyyy}}   $$000===IIVVVcccpp~~~###333DDTTTeeevv)));;;NNaaattt! ! ! 5 5 I I I \ \ \ p p                    "---'---M3 M3 a ------'---M3 M3A Q  F2 q2*Grafikon 2. higijenska ispravnost uzoraka a*F#?FF#F##FFFF??F#?F*F=FF?##F?F*F?F#2 prema PravilnikuF*FhF#S*F=F?F----'---  a ---'---  a -- -4- "-w o---- -` "??l- - - -   2  udovoljava 2 D 35%'  a -------- -k- - - -  2  ne udovoljava 2 i65%'  a ----G---- -----p---- --- -'  a  '  ';\-"Kn"\ #,##0.00)$"Kn"\ #,##0.00;[Red]\-"Kn"\ #,##0.00>*9_-"Kn"\ * #,##0_-;\-"Kn"\ * #,##0_-;_-"Kn"\ * "-"_-;_-@_-,)'_-* #,##0_-;\-* #,##0_-;_-* "-"_-;_-@_-F,A_-"Kn"\ * #,##0.00_-;\-"Kn"\ * #,##0.00_-;_-"Kn"\ * "-"??_-;_-@_-4+/_-* #,##0.00_-;\-* #,##0.00_-;_-* "-"??_-;_-@_-16Arial16Arial1Arial1Arial1,Arial1Arial=V,##0.00_ZR3  @@    A` J ` J ` t883ffff̙̙3f3fff3f3f33333f33333\R3&STUA@@P@WYd((#= />X46(  x  6  @AA? v s ]  $<udovoljava 35%<~rr  0 @AA? T]   $<ne udovoljava 65%<mrr  0 @AA?w] \ $rr  0 @AA?$] $ $*3d 3QQQQ3_4E4 3Q  WestQQQ3_4E4 3Q NorthQQQ3_4E4D$% M 3O&Q4$% M 3O&Q4FA>% 23O>& ? 523  O432" :2dd3_ O MM  MMd444% R7 ]M03O@,&Q x:Grafikon 2. higijenska ispravnost uzoraka prema Pravilniku'44     ''  ' ' '  ' '  '_979367382 F7;7;Ole iPRINTjCompObjqb  '$A FMicrosoft Graph 97GBiff5MSGraph.Chart.89q  AB""Kn"\ #,##0;\-"Kn"\ #,##0#"Kn"\ #,##0;[Red]\-"Kn"\ #,##0$"Kn"\ #,##0.00;\-"Kn"\ #,##0.00)$"Kn"\ #,##0.00;[Red]\-"Kn"\ #,##0.00>*9_-"Kn"\ * #,##0_-;\-"Kn"\ * #,##0_-;_-"Kn"\ * "-"_-;_-@_-ObjInfosWorkbookt_979364587F7;7;Ole ,)'_-* #,##0_-;\-* #,##0_-;_-* "-"_-;_-@_-F,A_-"Kn"\ * #,##0.00_-;\-"Kn"\ * #,##0.00_-;_-"Kn"\ * "-"??_-;_-@_-4+/_-* #,##0.00_-;\-* #,##0.00_-;_-* "-"??_-;_-@_-1Arial1Arial1Arial=\ A ,##0.00_2  A` J ` J 883ffff̙̙3f3fff3f3f33333f33333\R3&STUE@S@^@WYr(#= />X43dD$% M 3O&Q4$% M 3O&Q4FA 3O 3 b#M43*#M! M4523  O43" F 3OF% M3OQ423 M NM443_ O MM  MMd4444  FMicrosoft Graph 97GBiff5MSGraph.Chart.89qPRINTj5CompObjbObjInfoWorkbookFmB* '   ( ''  "Arial---b"Arial------------"Arial------"System-'- ( -'- ( -'-   - "-  $sxQ x s - $ssxs$xQ Q xx @9 "-sxxQ sQ sQ 8s  Q hs;;Q sllQ sQ "---'---    -  $Q x sxQ x "- @9$ssxs$xQ Q xx---'-- -   "-MM -  MMMM $1x -  $11- ss -  ssss$1M11 "- M3 -  M3M3$SSexS3f -  3f$SS- s&M - s&Ms&M$SeeS "-  f -  ff$-YYx -  $SS--S- - $-YS-- "-  f -  ff$Z-x -  $ZZ- - $Z-Y-ZZ "-  33 -  3333$__x_ff -  ff$__-MM - MMMM$__ "-  @@ -  @@@@$  4e e x  -  $__4 4 _-`` - ````$ 4e _4 4 "-  3f -  3f3f$  4  x f -  f$  4 4  -M - MM$ 4 e  4 4 "-  ff -  ffff$k k r E xk  -  $  rk rk  - - $k r E E rk r "-  @ -  @@$  q dq x -  $k k   k -` -  ``$ q d dk   "-   -   $   d x  -  $     - -  $  dq d   "-   -   $v v  n xv  -  $  v v  - - $v  n n v "Arial------'---  Z   2 $110888----'---    -----'---  n  2 )7688----'---    -----'---  V  2 6188----'---    -----'---  =  2 L3288----'---    -----'---   z]  2 w1988----'---    -----'---  \(   2 1188----'---    -----'---  \ I   2 X 1188----'---    -----'---  i    2 " 58----'---    -----'---      2 ( 28----'---    -----'---   q   2 ( 28----'---    -----'---  u    2 2. 18----'---    -- "- s ssZsZsZ8s8ZhshZsZsZ- 2 l08 2 2088 2 4088 2 6088 2 .8088 2 _100888 2 120888----'--  > 2 M broj uzoraka8!8818!828---'--    s  ss  ------'--  p  $2  bakterijska skupina8828!228228888---'--    --'--  ( ----'--  ] ST '2 mc@Grafikon 1. Uestalost bakterija u skupnim uzorcima mlijeka---'--  ( --'--  ( --  @9---'---   <=---'---   <= "-  -   ] .%2 +Koliformne bakterije5,,A,,,,(,,.---'-- -  <=---'-- -  <= "-3f -  3f q]@ .2  MikrokokiA(,(,(.---'---  <=---'---  <= "-  -  ] .2  Enterokoki5,,,(,(.---'---   <=---'---   <= "-  -   # ]  .2 6 S.aureus 5,,,,(.---'-- -  <=---'-- -  <= "-ff -  ff   .2  +Hemolitina E. coli.---'---  <=---'---  <= "-  -   q@ .%2  Streptokoki C i E5,,,(,(95.---'---   <=---'---   <= "- f -  f   .!2  Pseudomonas spp.5(,,,,A,,,((,,.---'-- -  <=---'-- -  <= "- -    #   .2  6 Bacillus spp.5,(,((,,.---'---  <=---'---  <= "- -  z I  .2 } + Proteus spp.5,,,((,,.---'---   <=---'---   <= "- -   z qI @ .%2 } Serratia marcescens5,,,A,(,((,,(.---'-- -  <=---'-- -  <= "- -   z I  .2 } S. agalactiae 5,,,,(,,.---'-- -   <=---'-- -  ( -- ' (  '  '  AB""Kn"\ #,##0;\-"Kn"\ #,##0#"Kn"\ #,##0;[Red]\-"Kn"\ #,##0$"Kn"\ #,##0.00;\-"Kn"\ #,##0.00)$"Kn"\ #,##0.00;[Red]\-"Kn"\ #,##0.00>*9_-"Kn"\ * #,##0_-;\-"Kn"\ * #,##0_-;_-"Kn"\ * "-"_-;_-@_-,)'_-* #,##0_-;\-* #,##0_-;_-* "-"_-;_-@_-F,A_-"Kn"\ * #,##0.00_-;\-"Kn"\ * #,##0.00_-;_-"Kn"\ * "-"??_-;_-@_-4+/_-* #,##0.00_-;\-* #,##0.00_-;_-* "-"??_-;_-@_-1Arial1Arial1Arial1Arial1|Arial1Arial1cArial1Arial1Arial1Arial1Arial1Arial=,##0.00_@  A` J ` t"H` J ` ` % ` % ` -K 883ffff̙̙3f3fff3f3f33333f33333\R3& S TUKoliformne bakterije[@ MikrokokiS@ EnterokokiN@ S.aureus @@1Hemoliti na E. coli3@Streptokoki C i E&@Pseudomonas spp.&@Bacillus spp.@ Proteus spp. @ Serratia marcescens @ S. agalactiae  ?WYd((#= &/>X483d< 3Q ,Koliformne bakterijeQQQ3_4E4 3Q  MikrokokiQQQ3_4E4 3Q  EnterokokiQQQ3_4E4 3Q  S.aureus QQQ3_4E4 3Q ,Hemoliti na E. coliQQQ3_4E4 3Q ,Streptokoki C i EQQQ3_4E4 3Q &Pseudomonas spp.QQQ3_4E4 3Q  Bacillus spp.QQQ3_4E4 3Q  Proteus spp.Q QQ3_4E4 3Q ,Serratia marcescensQ QQ 3_4E4 3Q  S. agalactiae Q QQ 3_4E4D$% M 3O&Q4$% M 3O&Q4FA; 3O ; 3 b#M!  NM43*#M& ! M! M NM4%  M3Oi& Q *bakterijska skupina'4% WM3OD& Q  broj uzoraka'43" :dd 3O % M3O&Q443_ M NM  MMd 444% Op M03OH& Q @Grafikon 1. U estalost bakterija u skupnim uzorcima mlijeka'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q'4% MP3O&Q' 4% MP3O&Q' 44 _988612386F7;7;Ole PRINT  CompObjb FMicrosoft Graph 97GBiff5MSGraph.Chart.89q  AB""Kn"\ #,##0;\-"Kn"\ #,##0#"Kn"\ #,##0;[Red]\-"Kn"\ #,##0$"Kn"\ #,##0.00;\-"Kn"\ #,##0.00)$"Kn"\ #,##0.00;[Red]\-"Kn"\ #,##0.00>*9_-"Kn"\ * #,##0_-;\-"Kn"\ * #,##0_-;_-"Kn"\ * "-"_-;_-@_-80     \ a ''  "Arial-----"System-'- \ a -'- \ a -'- < A "-- ) sMM - "-MM - MMMM$zz z - $ zzzzM3 - M3M3$ a f f k q v v {                               v m b b X M M C 7 , ,       # # ' + + / 3 6 6 : >} A} An E^ H^ HN K> O. R. R U X X[^aadffiknnpp]rKuKu8w%y%y{}~~wccO;''p\\H3 ~~jVVB/~~}{yywuurqp_n_nMk;i)f)fdaa^[XXURROKHHsEdAdAU>F:7676)3/ + +'## ~~tjaaXOGG>77/(!! {vvqkffa !!( /77>GGO"X'a,a,j1t5~:~:>CCGLPPTYY]aeei m mq)u7x7xF|Udds));M__q/BVVj~~ 3H\\p'';Occw%%8KK]p   . . > N ^ ^ n } }   | x x u q m m i e e a ] Y Y T, P, P7 LC GM CM CX >b :b :m 5v 1 , , ' "                                    a3f - 3f$33344556'6'6;7O8c9c9w:<<=>@@BCCEG%I%I8KKMKM]OpQTTVYY[^aacff i l. p. p> sN vN v^ yn }} }                  , 7 C C M X X b m v v                       " ' ' , 2 7 7 < A A F L Q Q V [ [ a f k k q v v {                               v m m b X M M C 7 7 ,        # ' + + / 3 3 6 : > >} An En E^ HN K> O> O. R U U X[^^addfikknpppp]rKu8w8w%y{{}~wwcOO;'p\HH3 ~jVVB//~~}{{ywuurqpqp_nMk;i;i)fdda^[[XUUROKKHsEsEdAU>F:F:76)3)3/ +''#  ~ttjaXXOGG>7//(!! {vvqkffa[[VQLLFAA<722,''" !!(//7>GGOXXajtt~ ))7FFUds}s}yvvsplliffca^^)[;Y;YMV_TqQqQOMMKIGGECCB@/>/>B=V<V<j:~9887666544 43333H3\3\3p3pa3 "---'---3f \ a ------'---3f A Y  2 x1/Grafikon 4. Uestalost listerija u pretraenim -2 uzorcima sirovog mlijekaA;A';aA!;'A9AA!!aA;A----'--- \ a ---'--- \ a -- -4- "-b---- -vj"Arial- - - -   2 u pozitivno 2 (0,83%' \ a ----tWz---- -kw_- - - -   2 j negativno 2 99,17%' \ a -- -' \ a  '  'ObjInfo!Workbook _988612500($F7;7;Ole ,)'_-* #,##0_-;\-* #,##0_-;_-* "-"_-;_-@_-F,A_-"Kn"\ * #,##0.00_-;\-"Kn"\ * #,##0.00_-;_-"Kn"\ * "-"??_-;_-@_-4+/_-* #,##0.00_-;\-* #,##0.00_-;_-* "-"??_-;_-@_-1Arial1Arial1Arial1Arial1@Arial16Arial1Arial1Arial=D,##0.00_.bZ  3  @@    A` |` J ` J ` |883ffff̙̙3f3fff3f3f33333f33333\R3&STU?]@WY<(#= V/>X4H0(  x  6 @AA? ;]H $<pozitivno 0,83%<\xx  6 @AA?^U] $<negativno 99,17%<h \3d   3QQQQ3_4E4 3Q  WestQQQ3_4E4 3Q NorthQQQ3_4E4D$% M 3O&Q4$% M 3O&Q4FA ^3O ]523  O43" :dd3_ M NM  MMd444% ]R M03O*&Q HGrafikon 4. U estalost listerija u pretra~enim uzorcima sirovog mlijeka'44  FMicrosoft Graph 97GBiff5MSGraph.Chart.89q  AB""Kn"\ #,##0;\-"Kn"\ #,#PRINT#&CompObjbObjInfo%'Workbook 72      7 ''  "Arial-"Arial------"System-'-  7 -'-  7 -'-   "-- s ]9MM - "-MM - MMMM$\\ - .$      444HHH\\M3 - M3M3$C BC GC GB MA R@ W@ W> \< a< a: g8 l5 q5 q1 v. {* * % ! !                           ~ s s g [ [ O C 6 6 )            # & & ) -y 0y 0i 3Y 6Y 6H 98 <' ?' ? A D DFIKKNPRRTtVtVbXOZ<\<\)]__`bccdeefgyhyhfiRj>j>j*kkkklllllllkvkvkbkNjNj:j&ihhgfeedccb`v_v_c]P\P\=Z*XVVTRRPNKKIFDDvAe?e?T<C93636"300-)&&#} p p cVVI<00$ {{upkkfbb^{ZvWqWqTlQgOaOaM\LWLWJRIMIGIGIBIIIIJLLMOOQTWWZ^bbfkkpu{{ ! &**$.0202<6I:V>V>cBpFpF}JNRRUY\\`ccfjmm"p3s3sCvTye|e|v~*=PPcvv&:NNbvv*>>Rfyy)<<Obtt   ~' |' |8 yH vY sY si py my m j f c c ` \ \ Y U R R N J F F) B6 >6 >C :O 6[ 2[ 2g .s *s *~ & !                         ! ! % * * . 1 5 5 8 : < < > @ @ A B C C C C B3f - 3f$>RRfy ""#$&&)'<)<)O+b-t.t.0225799<>> A C C' F8 IH LH LY Oi Ri Ry U X [ [ ^ b b e i l l p t t w { {) 6 C C O [ [ g s ~ ~                            ! % * * . 1 1 5 8 8 : < #> (> (@ -A 3A 3B 8C =C BC BC GB MB MA R@ W> \> \< a: g: g8 l5 q5 q1 v. {* * % ! !                           ~ ~ s g g [ O O C 6 ) )            # & ) ) -y 0y 0i 3Y 6Y 6H 98 <' ?' ? A D DFIKKNPPRTtVtVbXOZOZ<\)])]_`bbcddefggyhfifiRj>j*k*kkkklllllllkvkvkbkNj:j:j&ihhgffedccb``v_c]P\P\=Z*X*XVTRRPNNKIIFDvAvAe?T<T<C936"3"30--)&##} p p cVVI<00$ {uppkffb^{^{ZvWqTlTlQgOaOaM\LWJRJRIMIGIGIBI=I8I8J3L-L-M(O#O#QTWWZ^ ^ bfkkpuu{ $0<<IVVcp{}w}wtpplieeb^^[XXU"R3O3OCLTITIeFvCAA><<9755200.*-*-=+P)c'c'v&$$#"  &&:NNbvvB> "---'---3f  7 --------'---3f y \--  2 {"Grafikon 4. Uestalost bakterije - 2 {qE. coli - 2 { O157 u 2 pretraenim uzorcima mlijeka----'---  7 ---'---  7 -- -4- "- {--- - -"Arial- - - -   2  pozitivno 2 H1,67%'  7 ---- mP--- - -dX- - - -   2 c negativno 2 F98,33%'  7 -- -'  7  '  '#0#"Kn"\ #,##0;[Red]\-"Kn"\ #,##0$"Kn"\ #,##0.00;\-"Kn"\ #,##0.00)$"Kn"\ #,##0.00;[Red]\-"Kn"\ #,##0.00>*9_-"Kn"\ * #,##0_-;\-"Kn"\ * #,##0_-;_-"Kn"\ * "-"_-;_-@_-,)'_-* #,##0_-;\-* #,##0_-;_-* "-"_-;_-@_-F,A_-"Kn"\ * #,##0.00_-;\-"Kn"\ * #,##0.00_-;_-"Kn"\ * "-"??_-;_-@_-4+/_-* #,##0.00_-;\-* #,##0.00_-;_-* "-"??_-;_-@_-1Arial1Arial1Arial1Arial1Arial1Arial11Arial1Arial1Arial=~,##0.00_DZR3  @@    A` ` ` J ` J `  883ffff̙̙3f3fff3f3f33333f33333\R3&STU@]@WY4&= V/>X4<$(  r  0 @A?qf ]H $<pozitivno 1,67%< \ rr  0 @A?*3 ] $<negativno 98,33%< hJeq3d a 3QQQQ3_4E4 3Q  WestQQQ3_4E4 3Q NorthQQQ3_4E4D$% M 3O&Q4$% M 3O&Q4FAL 3O8 523  O43" :dd3_ M NM  MMd444% M M03O.+&P"*MQ MGrafikon 4. U estalost bakterije E. coli O157 u pretra~enim uzorcima mlijeka'44 _988612592*F7;`|7;Ole PRINT),CompObjb9#     f ''  "Arial----------"System-'- f -'- f -'- F "-- Bt 1MM - "-MM - MMMM$bb=Y - v$9&&&;;;OOOcccwww)))<<<OOObbM3 - M3M3$% % % $ # " "                           $ ) ) - 2 7 7 ; @ E E Iv Mv Mk R` VT ZT ZI _= c= c0 g$ k o o s w w {          z j Z Z J 9 9 )    yygTTA.lYYE1 |hTT@,,zgSS@--uddSBB1 uugY{LwLw>s1o1o%kg c c_ZZVRMMIEE@;772-))$xxpicc\ VVPKFFA==9522/,**(''%$$$$$$$$%''(* * ,/225!9&=+=+A0F5F5K;P@VEVE\IcNcNiSpXx]x]bggkpuuy~  %11>LLYguu 1BBSddu--@ S S g z,,@TTh| 1EYYl    .ATTgyy   ) 9 9 J Z Z j z                 $ 0 = = I T T ` k v v     ~ y u u p k g g b ] ] X S N N I E E @ ; 5 5 0 + + & !       " " # $ % % % % 3f - 3f$.AATggy   ) ) 9 J J Z j z z                 $ 0 0 = I I T ` ` k v v      # # ( , 1 1 6 ; ; ? D D I N N S X X ] b b g l q q v { {       " " # $ $ % % % % $ # # "                             $ ) ) - 2 2 7 ; @ @ E I Iv Mk Rk R` VT ZT ZI _= c= c0 g$ k$ k o s w w {           z j j Z J 9 9 )    ygTTA..lYYE11  |hTT@,,zgSS@--uddSBB1  uugY{Y{Lw>s>s1o%k%kg c c_ZVVRMMIEE@;;722-))$xppicc\ VVPKKFAA=9952//,**(''%$$$$$$$$%'((*,,/225{9v9v=qAlAlFgKbKbP]VXVX\ScNiIiIpDx?x?;661,,(##    %%1>>LYYgu  1BSSduu-@@Sggz,@@Thh| "---'---3f f ------'---3f  J  N2 i$/Grafikon 5. Rezultati imunoenzimnog testa za ['A!;AA!A!!TA;A!A!!aAAAAA;aAAA!!!A;!A!;A!!2  salmonele;AaAAAA----'--- f ---'--- f -- -4- "-' ---- - "Arial- - - -   2  pozitivno2 p5%' f -------- -- - - -   2  negativno 2 )v95%' f -- -' f  '  '      !"#$%&'()*+,-./01345678:;<=>?@B FMicrosoft Graph 97GBiff5MSGraph.Chart.89q  AB""Kn"\ #,##0;\-"Kn"\ #,##0#"Kn"\ #,##0;[Red]\-"Kn"\ #,##0$"Kn"\ #,##0.00;\-"Kn"\ #,##0.00)$"Kn"\ #,##0.00;[Red]\-"Kn"\ #,##0.00>*9_-"Kn"\ * #,##0_-;\-"Kn"\ * #,##0_-;_-"Kn"\ * "-"_-;_-@_-,)'_-* #,##0_-;\-* #,##0_-;_-* "-"_-;_-@_-F,A_-"Kn"\ObjInfo+-Workbook 1Table <SummaryInformation(02 * #,##0.00_-;\-"Kn"\ * #,##0.00_-;_-"Kn"\ * "-"??_-;_-@_-4+/_-* #,##0.00_-;\-* #,##0.00_-;_-* "-"??_-;_-@_-1Arial1Arial1Arial1Arial1Arial1Arial1Arial=A,##0.00_8H 3  @@    A`  `  `  883ffff̙̙3f3fff3f3f33333f33333\R3&STU@\@WY4&= />X4H0(  x  6 @AA? ]H $ < pozitivno 5%<K pxx  6 @AA?1 ] $ <negativno 95%<W p?3d 3QQQQ3_4E4 3Q  WestQQQ3_4E4 3Q NorthQQQ3_4E4D $% M 3O&Q4$% M 3O&Q4FA7 1 3O7p1 523  O43" :dd3_ M NM  MMd444% HP M03O#*Q t8Grafikon 5. Rezultati imunoenzimnog testa za salmonele'44  Oh+'0t  $ 0 < HT\dlbenicfeni.....NormalVeterinarski fakultet828eMicrosoft Word 8.0e@;@ -&@rb#@.3Y,` ,tAȒ3GU'6 W좥= 2, ,d"Jj004iDdH!< $ C A? 2~tH飸FvZD`!RtH飸Fv8x R`6 xŘylUǿ= ( (eiT1cW(1jX-[+B5J9jB-rl \"$(xzp(δZlU'켙yw;oQ c=#(B>D_<G@ڳ>o"UJ2o~ej&{M>R_}(0i7VغBw:7׺vйx:_"tE/'2x0[qcwx/zxM!iIMMMck9'M~Y˹zذS+Zq$UbN(n&py6M>wz䠒YXSK,c1ba!A,(!/1__E~BZ>Y<iSY'y&ql@?"[<Ÿ0?! >1'Ie}zn4t1H iHDH,N8!T:&_$b։Zb3~&.~F bZWT c92Y\H|E ``<+K!!T{1Eŧ]!:!_b*"9$q:q&:sz,DsЅEytIa)zpb s9zrzY X-Bn@n流77NGGfJfFfB͈̀F.³0 Bn"E}"M A"] ׊؟7[P.1\P؏#>qx''ٛ)3<< ,ES,Td/+؅KLf"^,e'ą r2YL?'g:kԆGTUJwjWjTN1+2V^JYSbJƣ"+b\bi%|S4Y9ғ"\bK^X#irTaaTbXC*ZGQEQ&* *eVQA8dUX'WU&yT%9ʣRWUFGGU=rȣ*=գ*5UUUyU,U) UeUQ||(Qݎ9ʲSK"6*kl~$ۛC@>ߗ QL5mŸQ Q17HT.:N9UkFOWU,TV%Ud"\hWW*JeYToT*ԣ AƢ\cR)k5f]v ì?wѩwEӺmZ˭:0hN[竓{`$U:.r!g2bY1Gs2Yc9#HnF$IHFU ?ҵ͙Kzbj"Aq *18>#{LN43;0möuqN߶/=,mo -gDRFSyȥac>x>@ow;X~ȥvw8:7BSi[9?yN!Ϲ0T5jʖ4l"qBܹp_ЉJr5hڮo0қGSKk:e$gz' [;hb˚i1~W :7f_#`!,'^겡r>_$8OCx͘ lTU9] .ZPMkifM (hERI+}`[p]3!!]$dMcK(PA|HETsgzUpu;̹ͯ3D"s(H@]PnuueIv`+F~V :3Hb]t!3Ss,~D(E.%2z8H ׈"Uf2SK1"dY,Vъ=G^[BWHKbhU)j52eh5ȿ% bH,< 1W܇P.Jq%f sY܃0g0 .ɝ8)8p8|!n8x&n)b%_eg]|x|%fɷl:[>ϑs1db3V1Ur\.O1S,SbS}O1)>@r!_9ȷ2+Y">O9Snc>O9SUr2W\Q.(,|r=z2Ј 8 bͲQ2\)KV:>kZ= 2i\˫H/׳?77iM}جUmU-ZV^)zq1"Yճ3O )RE_ oYV,:(nb=nbLbL1Wy\Bn"MRz7KL-X.Vpkj3+l;Y͝RQ'5R]X|jnlT^m^>l~~)kuR؃Mm8T] •"3ED9T79T8ǡC*upO 9Tk[ بQ[ j+Ql%6*Vb^%6JlTxT(QJЈ/ G%Q%. GȡĿw(%*q>v(oC-ڽUs@¿iR=w߭7.ٳKv7sݩ7vٿ]xNiպi}[wݬ7&E 6bX z,,jЈZ QiP5af'/N:T6qT'ǂ`PAE!Ea"Dq؛:;4CǺ;|'j JꉩҸb2o0Nj* K+%~* ss** k^ zV$SU@y i_Q>^?hvR NWvIǔTg=0g~Q]?aO_|ty9{Y]_iOnGB;jkacduD⟩T.v+~Rb::$ا&;sK䗮2 g#  v>{:9ȇ_0kS?\eWj_i,1$;cwbSs%>>J0QvrmG0>(+郳8rr=VHWH6WHDd<   C A? 2FJ͌ܠq f""z!`!J͌ܠq f"N Gx՘ pT<"Ԉ.1"V I]H<a2:Zi3dR'Չ*% b0ΔPJIwIE+Nw]x((=+#-AOz3=t' {3B/wa9K R_*h}HK}(ZZI]WW_R)]~>vfk'f&&t'~$Tr4Hsmg"D;#c_͵?4L%+ruNN@1f3lgkVuQg\hD+-*FrS|A*sF GG=`{xF)CZHQp=N{&s>֔V9ke*'-jPvh5AxH?ktIt6أU]t>Wh!4kl֜6ngb/!",%Fy*Aa>\FLx^AWrP@. I!)$GE䪈brXL.ɩEn-rlk[B>C>C#>C3>CCZД,4f5 b4Xd,Bhh hz^Ɨh~ϧ;L^iٯZzYڴk| wa=kq!oq }kyv_8vj8oyQy7;k~׸q2k׭u待n}s]{}g7#]r8ܷ]{.݃}K8'E#r)|nJNK|&tK]ʹϬSR-9)u4Gru%[ޓSyWUwQޖ%[MyTɯIސfy]~ OQidW 尴+)8rޝ,tV!9y A؞{ .W4~Ww{Sc; >uQ}rTOB*91!Y5[jRyuwR׻DI]UQ]WY%oxD|5/ݻ >+`Q\e~Ѫ-+WzW׮WZ &).g.?+t]\Nyl$7dpyi;&mۚ'%3h4j/O8^u(>fz(y- sB{ť/ݙkB%8p =v;OšX8k?jo+6{^YU- f߬(sܔon{(S/xe)lg17ĠdA ٱO5v_K_|\kiVDd (<  C A? 29w%t<'P*`! w%t<'/Xp>Q1x՘ pUK$aPkҢÌkN*[*^ DadLBYR {X [0b(2.0 ;n*nӗ{r;Ĕ*%4 _ 6,ŔL)Zy琅'-CCO(R75ro{-_hBmЉ_q8 ʥKuVͽ1P(c1:.b}1 \K/~]J=&RF yImmmc?I~α{Kqyc;*nڛ%zKΧɾY|ԚRϤ]eK5OQ~ٻNVQ "Ww,Z{j?0Bo_ol~V0\ﮍF{:̷˪IljթvNإ=ck= iϨΞ}͞W{A6B:;5^ {IUvX*;E۫ki6*7Tjo4joa{Gٻ =MU;\ȱ4Žk8 2n;;v`'u #>ppҕ CKHf)G: ޅP0 }P[Zhi,Z K+SGQUNU'NYթH_YKN U6 (ueP6e t@Yh@YuW@Y7 e]&un1oP@;հ^:_K?k4\w%_b\˕z.U;*5Lc"MػQ1?sUy jT,Zg2rFTg0XQUeXYt泃W+~!_OZU6҂%bE"Znb5WW)=v"Z{)|)q{-bq-SZ|W{Ew.:oE >ΖL䩅w5MIFK8_ȭ<wgvH]o![.KpҿANDd `<  C A? 2Zv55@W虠W6aZ`!.v55@W虠WZ,XPv<xY]hU>f2["HcV<$1*BՒ m >$M-RP> y<>(ZJP% -TZXϹwY7;Rp2~sϽ3{w,8|I,5R bp Ғbh!mğRŽғ=m$>FA{unҙ&}uq5LJoTw6H<~˜@!ro):60]Qs[1ǭE㭅9x ⠯k~G<.=FgZylẙQ䶞oyyxc޸mf]l*v=!w5WA|b$+=i]nkXXѴh caW^6szX븱+gE۟=4ʟ#3NrN&ݝLlYMɲ ZmjEViUMU.^,vC4ޖhy[ºM]شP.`L*T?Z+zgOeuS;b֣x ¯e}!j*jWwijKVK(&pw^[)ۛ3kđ5Ȟ"ጎ.]u8$s93C=Yg쟏Z򟚃QN}N|ygf0wRW 杊; ֟Cȸߎ|f{2 a?X|{.6ؐTD~erS=gV2Ư`P 8a\)G'xIcA*5[qn"ȹnIԘ;l` iS0s[!_V /fTS6C4גʿh#k*E3 b^aH{mΙ<>{r=:9;ޓyڱOqC=73y{5;I>'zg Dd ]<  C A? 2~FI GNZ`!RFI GNH$8O9 xŘ PUeE2bV[m;nZ#n :J*889:MC ,4\&F(@ii{ jsޏ}9^"Z0$PD]%;#6Nyۺ~+gV'Zƈm nX E)*o4}6f3'uƔ$4z M,2=u_b:lv]7IKKCo[U\.8A͵i̳4u7Zul5{Ô7('B '*} 77wh3L ZshRM'qQ#~GKmD;HAWrSS<8g\mcHQ$A<>G Y2Q&}i4hXWF_K_};~;;~ƞ_JuϫF}]o5[c5&xɆ!}Rh1!P" cGGR+>&G$bMĉ)WHƵ-:ů9O<@,=')%%%%Лo57I%b(D؏(K$JqZ|o/vO5•j;_Lz>v!~kSvZyҼ4ٗ]x_a䁧"n=v] ھ}!ڂ1p-/mŪiTz Lgݱ{vΎ={nX hblYɉScgņZ׫fEkkK]/?Ceң큮LGPiGBvFf6/Fl/j<抎Q]߿QYsT|YDd@ <  C A? 2g;%xOkt`!g;%xOkt )kxcdd```9`,F3Y,` ,tAȒ3GU'6 W좥= 2, ,d"Jj004iDdH!< $ C A? 2~tH飸FvZD`!RtH飸Fv8x R`6 xŘylUǿ= ( (eiT1cW(1jX-[+B5J9jB-rl \"$(xzp(δZlU'켙yw;oQ c=#(B>D_<G@ڳ>o"UJ2o~ej&{M>R_}(0i7VغBw:7׺vйx:_"tE/'2x0[qcwx/zxM!iIMMMck9'M~Y˹zذS+Zq$UbN(n&py6M>wz䠒YXSK,c1ba!A,(!/1__E~BZ>Y<iSY'y&ql@?"[<Ÿ0?! >1'Ie}zn4t1H iHDH,N8!T:&_$b։Zb3~&.~F bZWT c92Y\H|E ``<+K!!T{1Eŧ]!:!_b*"9$q:q&:sz,DsЅEytIa)zpb s9zrzY X-Bn@n流77NGGfJfFfB͈̀F.³0 Bn"E}"M A"] ׊؟7[P.1\P؏#>qx''ٛ)3<< ,ES,Td/+؅KLf"^,e'ą r2YL?'g:kԆGTUJwjWjTN1+2V^JYSbJƣ"+b\bi%|S4Y9ғ"\bK^X#irTaaTbXC*ZGQEQ&* *eVQA8dUX'WU&yT%9ʣRWUFGGU=rȣ*=գ*5UUUyU,U) UeUQ||(Qݎ9ʲSK"6*kl~$ۛC@>ߗ QL5mŸQ Q17HT.:N9UkFOWU,TV%Ud"\hWW*JeYToT*ԣ AƢ\cR)k5f]v ì?wѩwEӺmZ˭:0hN[竓{`$U:.r!g2bY1Gs2Yc9#HnF$IHFU ?ҵ͙Kzbj"Aq *18>#{LN43;0möuqN߶/=,mo -gDRFSyȥac>x>@ow;X~ȥvw8:7BSi[9?yN!Ϲ0T5jʖ4l"qBܹp_ЉJr5hڮo0қGSKk:e$gz' [;hb˚i1~W :7f_#`!,'^겡r>_$8OCx͘ lTU9] .ZPMkifM (hERI+}`[p]3!!]$dMcK(PA|HETsgzUpu;̹ͯ3D"s(H@]PnuueIv`+F~V :3Hb]t!3Ss,~D(E.%2z8H ׈"Uf2SK1"dY,Vъ=G^[BWHKbhU)j52eh5ȿ% bH,< 1W܇P.Jq%f sY܃0g0 .ɝ8)8p8|!n8x&n)b%_eg]|x|%fɷl:[>ϑs1db3V1Ur\.O1S,SbS}O1)>@r!_9ȷ2+Y">O9Snc>O9SUr2W\Q.(,|r=z2Ј 8 bͲQ2\)KV:>kZ= 2i\˫H/׳?77iM}جUmU-ZV^)zq1"Yճ3O )RE_ oYV,:(nb=nbLbL1Wy\Bn"MRz7KL-X.Vpkj3+l;Y͝RQ'5R]X|jnlT^m^>l~~)kuR؃Mm8T] •"3ED9T79T8ǡC*upO 9Tk[ بQ[ j+Ql%6*Vb^%6JlTxT(QJЈ/ G%Q%. GȡĿw(%*q>v(oC-ڽUs@¿iR=w߭7.ٳKv7sݩ7vٿ]xNiպi}[wݬ7&E 6bX z,,jЈZ QiP5af'/N:T6qT'ǂ`PAE!Ea"Dq؛:;4CǺ;|'j JꉩҸb2o0Nj* K+%~* ss** k^ zV$SU@y i_Q>^?hvR NWvIǔTg=0g~Q]?aO_|ty9{Y]_iOnGB;jkacduD⟩T.v+~Rb::$ا&;sK䗮2 g#  v>{:9ȇ_0kS?\eWj_i,1$;cwbSs%>>J0QvrmG0>(+郳8rr=VHWH6WHDd<   C A? 2FJ͌ܠq f""z!`!J͌ܠq f"N Gx՘ pT<"Ԉ.1"V I]H<a2:Zi3dR'Չ*% b0ΔPJIwIE+Nw]x((=+#-AOz3=t' {3B/wa9K R_*h}HK}(ZZI]WW_R)]~>vfk'f&&t'~$Tr4Hsmg"D;#c_͵?4L%+ruNN@1f3lgkVuQg\hD+-*FrS|A*sF GG=`{xF)CZHQp=N{&s>֔V9ke*'-jPvh5AxH?ktIt6أU]t>Wh!4kl֜6ngb/!",%Fy*Aa>\FLx^AWrP@. I!)$GE䪈brXL.ɩEn-rlk[B>C>C#>C3>CCZД,4f5 b4Xd,Bhh hz^Ɨh~ϧ;L^iٯZzYڴk| wa=kq!oq }kyv_8vj8oyQy7;k~׸q2k׭u待n}s]{}g7#]r8ܷ]{.݃}K8'E#r)|nJNK|&tK]ʹϬSR-9)u4Gru%[ޓSyWUwQޖ%[MyTɯIސfy]~ OQidW 尴+)8rޝ,tV!9y A؞{ .W4~Ww{Sc; >uQ}rTOB*91!Y5[jRyuwR׻DI]UQ]WY%oxD|5/ݻ >+`Q\e~Ѫ-+WzW׮WZ &).g.?+t]\Nyl$7dpyi;&mۚ'%3h4j/O8^u(>fz(y- sB{ť/ݙkB%8p =v;OšX8k?jo+6{^YU- f߬(sܔon{(S/xe)lg17ĠdA ٱO5v_K_|\kiVDd (<  C A? 29w%t<'P*`! w%t<'/Xp>Q1x՘ pUK$aPkҢÌkN*[*^ DadLBYR {X [0b(2.0 ;n*nӗ{r;Ĕ*%4 _ 6,ŔL)Zy琅'-CCO(R75ro{-_hBmЉ_q8 ʥKuVͽ1P(c1:.b}1 \K/~]J=&RF yImmmc?I~α{Kqyc;*nڛ%zKΧɾY|ԚRϤ]eK5OQ~ٻNVQ "Ww,Z{j?0Bo_ol~V0\ﮍF{:̷˪IljթvNإ=ck= iϨΞ}͞W{A6B:;5^ {IUvX*;E۫ki6*7Tjo4joa{Gٻ =MU;\ȱ4Žk8 2n;;v`'u #>ppҕ CKHf)G: ޅP0 }P[Zhi,Z K+SGQUNU'NYթH_YKN U6 (ueP6e t@Yh@YuW@Y7 e]&un1oP@;հ^:_K?k4\w%_b\˕z.U;*5Lc"MػQ1?sUy jT,Zg2rFTg0XQUeXYt泃W+~!_OZU6҂%bE"Znb5WW)=v"Z{)|)q{-bq-SZ|W{Ew.:oE >ΖL䩅w5MIFK8_ȭ<wgvH]o![.KpҿAN;r4* ՜.+,D՜.+,0 hp|   }!o  benic Title 6> _PID_GUIDAN{047EF820-92A7-11D3-97A1-C76964D2BC4DDocumentSummaryInformation89CompObjAj     !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmno}  FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.89q Heading 2$ & F@&CJmH4@4 Heading 3$@&CJmH4@4 Heading 4$@&CJmH <@< Heading 5 $@& 5CJmH 8@8 Heading 6$@& 5CJmH@@@ Heading 7$!4 .KJ 4s 4.A i4. P4.$J 4@ 4hg!4.KJ 4s 4.A i4 OLE_LINK1lkSlmkSl !")*78ABMPWY_dlu|~  %,2378ABJKMNZ]dfkw}  !)   $'./9:<EOPW^fgijmnxy~  !")*129:CEGW\]_`gjqrv{ !'(*+45=>FIRT[\efpqst{}%&./23=>KLWYdefgyz ()0189;?FGNQXY[\fgijos|#$%)-8?@CDMNRS[]deop{|        % & / 0 6 7 9 : < = G H T U _ b m n t x  k m n u v } ~  ! " ( 6 = > E Y ^ _ m     " ' ) 2 = H J T V _ a b d p t } ~ KMST!%&(*/0rt[{LNmp03~*0 %&:;>?GHbe345;<KLPRVWact|}~   '(01239:@CMORTZ\f.19:]_ [$@$NormalmH 8@8 Heading 1 $$@&CJmH<@< Heading 2$ & F@&CJmH4@4 Heading 3$@&CJmH4@4 Heading 4$@&CJmH <@< Heading 5 $@& 5CJmH 8@8 Heading 6$@& 5CJmH@@@ Heading 7$@& 5CJmHB@B Heading 8$$dh@& 5CJmH< @< Heading 9 $$@& 6CJmH <A@<Default Paragraph Font.B@. Body TextCJmH8P@8 Body Text 2dhCJmH 6Q@6 Body Text 3 5CJmH.>@".Title$ CJmHnH FC@2FBody Text Indent dhCJmH @` @`Rl      @` @`     4xRl66U6v66"26@ ~`h, #\2_eaio{ !.*&2x33i#QyN`~ 6l jU "8+R4@Or]$g|l{օV\Ze:.Ld'AQk{"CS[$XxNn8H  06CpCOOG[fvbdeghjlmpqrstuvxyz|~  $|3m$"v? :+|;fV$ghx؅  4IM.9S\l\0HC`OOWduicfknw}   ;=@[]`{} ;=@[]`{}::::::::::::::l,2$H>G/AyA\N6@F(  N  S A ?N  S A ?N  S A ?N  S A ?N  S A ?N  S A ?N  S A ?N   S  A ?N   S  A  ?N   S  A  ?N   S  A  ?N   S  A  ?N  S A  ?N  S A ?B S  ?$fIgUgVijjj3?@Rl . P4 .$J 4 @ 4 hg ]delo( - 0 : < I w ~ !!! ! !!!!!!!$!'!/!1!3!5!?!A!J!L!N!P!W!\!c!e!k!m!v!x!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"" """"!"#","."4":"<">"D"F"J"L"U"W"b"d"h"j"r"s"u"v"{"~""""""""""""""""""""""""""""""""""""##### #!#&#(#.#0#9#:#<#>#E#G#N#P#S#U#^#`#m#p#z#|##########################$$$ $"$$$&$,$;$A$C$J$L$M$O$W$Y$[$]$d$f$m$o$t$v$x$z$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$%% % %%%%%%%'%(%*%7%9%?%B%K%M%V%Y%b%d%e%g%o%t%x%%%%%%%%%%%%%%%G&H&M&O&S&V&Z&[&]&^&c&e&q&s&v&w&y&{&&&&&&&&&&&&& ' '''-'/'^'_'~'''''''''''''''''''' ("(((*(L(O(V(X(((((((;)<)F)H)R)T)))))))))))))))))))))))))))))** * ***"*$*+*-*K*M*W*Y*_*a*h*i*q*s*t*v*******++++++++++,,,,,,,,H-I-R-T-]-^-----------=.>.G.I.P.Q......../////////#/%/,/./1/2/8/9/;/1s1t1v1x1z1|11111222 22222224252?2@2I2K2P2S2T2V2]2_2a2c2u2v2z2|22222222222222333"3#3.3/38393E3H3Q3T3f3h3q3s3x3z33333333333,4.494;4j4l4o4p4r4t4x4z44444444455 5 55555&5'56585=5@5C5E5w5z5|5~55555555555555566666677 7 7777777(7*7G7H7N7P7W7Y7a7b7i7j7l7m7v7w7777777777777777777777777 8 8 8 888 8"8*8,8G8J8N8O8U8V8W8X8c8d8h8j8r8t8w8y88888888888888888N9P9R9T9[9\9_9`9l9m9s9t99999999999999::: : ::::::!:%:(:/:1:<:?:F:I:N:P:Q:S:Z:\:]:_:::::::::::::::::::::::::;;;;;; ;!;#;$;*;+;3;5;?;@;C;D;E;F;L;M;R;S;T;U;V;W;X;Z;a;c;e;f;g;h;r;s;x;y;;;;;;;;;;;;;;;;;;<<<<<<<$<&<2<5<6<8<L<O<V<X<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<== = = = === ="=&='=)=*=6=7=8=9=@=A=L=M=Q=R=T=V=[=^=c=f=k=m=q=r=====>> > >>>>>>>>>?>F>G>L>M>O>P>T>U>]>^>_>k>l>n>s>t>>>>>>>>>>>>>?????? ? ? ??%?&?'?(?)?*?-?.?/?0?G?H?I?J?K?L?O?P?Q?R?j?k?l?m?n?o?r?s?t?u???????????????????????????????????????????@@@ @ @ @@@@@&@)@2@3@<@=@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@AA A A AAAA A!A*A+A,A-A9A;ADAGANAOAUAVA`AbAeAfAoApAxAyAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABBBBBBBB"B#B%B&B+B,B4B5B;BBGBHBNBPBTBUBVBWB]B^B_B`BcBeBmBoBtBwB|B}BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBCCCCCCC C'C(C,C-C5C7C@CBCMCNCXCYC\C]CeCfClCnCsCvCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCDD DDDDFDGDSDTD_D`DaDcDpDqD{D|D~DDDDDDDDDDDDDDDDDDEE&E(E;EG@GJGLGYGZGbGcGdGfGnGqGGGGGRHTH[H]HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHIIIIIIIIIIIIIIIIIIII:J=J>J?JAJCJJJJJJJJJ.K/K4K6K;K=K>K?KGKIKRKTK_K`KsKuK{K}KKKKKKKKKKKKKKKKKKKKL L LLLLL6L8L?LALLLLLLLLLVEVFVQVSVdVfVmVpVuVwVVVVVVVVVWWWW$W%WgWjWmWpWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWX!X%X&X,X.X/X1XGXIXKXMXUXvXxXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXYY'Y)Y.Y0Y9Y;YDYYYY Z ZZZZZZZ!Z#Z-Z/Z9Z;Z?ZAZCZhZqZsZvZyZZZZZZZZZZZZZZ[[[[[[[ \ \\\\\ \!\"\&\(\/\0\1\3\:\=\A\C\E\l\v\x\\\\\\\\\\\]]]]]]]]]]]]]]^^^ ^^^^"^*^,^1^3^6^X^]^^^g^h^k^l^w^y^~^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^_(_0_2_=_?_@_l_t_u_y_z_}_~____________________________8`>`@`J`L`N`t`y`z`|`}````````````````````````aa aaaaaaajakamanayazaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaabbbb b bbbbbb_bfbibtbvbwbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbcccccc!c"c#c%c0c1c2c3c4c6cAcCcDcGcLcNcVcWc_c`cfchcsctcvcwc~cccccccccccccccccccccccccccccccccccccdddddddddddd$d&d4d6d@dQdSddddddd0e1e8e9e|eeeeeeeeeeeeff"f'f?fCfffffffffg"g{E{H{P{[{c{e{l{o{s{u{w{y{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{|| |||||| |"|-|2|4|:|?|G|P|R|Y|[|c|f|o|u|x|||||||||||||||||||||||||||||||} }}}}!}#}-}/}5}7};}=}F}N}P}R}_}a}h}k}q}v}{}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}~~~ ~ ~~~~~%~)~+~-~/~2~=~D~F~N~P~Y~[~b~d~f~h~p~r~z~|~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~!$)+168;=GIWYaclotv'(/2:EMOPRY[`kuvĀƀ̀πր؀܀ހ !#&578BDMPXZbjlnw|Áʁ΁ցׁށ  )*1357<=EGNPQSZ\fhqrÂɂтۂ܂!+35>SV`jktwă΃؃ك !#.03=GHQT]^efkDŽʄ˄քׄ $%.078=hх҅z{78z|IMklnoz{Ɍʌz|ԍՍz|*+ <=UV #$[`tu z}/1WXAB&(LM/1VXڝ۝^_ٞڞؠڠce 34z} <>ܥޥz{z{ͬϬʭ%'egpq~ǮɮACce[]Ұ԰۲ݲ "*+\]_`@C]_pr57[]68UVżݾMO !_`bc3578]^`awx#$&'>OXZ_af}#%+-1368?BHJS\bhlnpv~ "%+-5:ACEGLNWYZ\dfjlnpsx ux&(y{464534 46FGYZgh46dfy|WZo{HI"#fi )-ilwz &'26< HITV]^efpqz  *.<Pkl&'"$23~!-;<U[_aklvz|%]^ 0>JKScmn{2@Bfg^_^_ik^`^`^adg'*:<^`dg+,#%    B D   ^ _ c e & )   ^ ` g i hj^`ab^_^_^_LO^`58ho^_`bz|^_  ^ ` ^!`!"#&#'#$$&&^(`( )@)R)S)^)a)4*5*B*D*****++^+_+++++++++,,U,V,--Z-\---d.e...*/+/C/E/////000000b1c12M2222222233333334444555566P6Q677778 8U8V8h8j888U9V9::$:%:r:t:::;;;;0<2<<<c=d=">#>>>3?5???0@1@A$AmAnAAA&B'BhBjBBB%C&CCCDDE!ExEzEEEEENFOFGG-G0G4G8GGGHHHHII J"JwJxJJJJJ K"KKK L\LLLLL@MAMMM N!NOOWOYOOOPP P!P~PPPPPPQQRRRRRR S*SWSXSSS:T;T U"UUUUU V"VVV[W\WyW{WWW%X'XXXXXXXYYY8Y9YZZ[[\\8\9\\\i]k]]]]]]] ^^2^5^8^=^Z^]^e^f^X_Z___8`9```````aaaaaa+b-bEbHbwbyb[c]cbcccecfctcucvcwc~ccccccccccccccccccccccccccd*d7d8dAdDdKdMdYd^d`dadcdddldmdrdtdxdzdddddddddddddddddddddddddddddee e eeee e(e)e0e1e5e6e7e8e=e>eIeJeLeMeXeYefeieneoeuevexeyeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeef ffff1f7f9fAfBfSfTf[f]f^fffqfvffSldh%} BCD^;HILNVoqxtY[25v w   B N ~   , - a b ~   %&?@\]~$/0IJ]^XY^h~FG9:XYfg,-z{STIJ|})0NO ""~"" ##p##$ $$$%%%''''''(((((<)R)))*+++++,,^---112222"3#3f3h34466@8C8r8t8<<<<&>(>l>n>s>t>>>>>>>>>>>>>>>>????? ?"?2?3?=???A?D?T?U?`?a?d?e?h?i?w?x???????????????????????@@@@AAAAAA]B^BBBCCCBDpGqGIIIJ;J=JXYYP[Q[\\__```a^b`b~bbdddddd/e1e{eeeeeeeeeeeeeeeeffffffffff!f%f>fCfffg"g,g-g;g=gAgBgDgEgGgJgNgOgQggh!h]hthzhhi iii(iDiQifiii-j0j7j8jMjNjXjYjnjojjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjkk!kWkZkppp qqjq{qr r#r3rrrrrssss~ssssssssst(tLtXtftytttttuu vvwwxxVxkxyyyyzz{{{{||}}}}}}~~ozĀÁׁ́hЅ҅68HMjlnoȌʌRSӍԍEF)+EFlmЏяڏۏ();<PQ^_pq $%MNtu ;=TV "$Z`su .1VX@B%(KM-1UXٝ۝]_|}؞ڞ؟ٟנڠbe 24 ;>ۥޥWXz{\]ϧЧ;<ST45ʪ˪ST̬ϬʭoqHI )+[]_`?C\_fg?@ٸڸ͹ι58TVWXżkl !^`bc2578\^`avx"$&'=T_arBS%5 %(x{4524CDgh "#'(+,./45@AEFRSXYfhvw}~$%()+,/0@ARScfstxy|}VZ !"34GI]^dejkopstvwei (- %'+,./1489; G^d.;P!"78BCXYjlyz%'13} !;<PQklst|%\^ijnostxy}~/0JKRSmnz{2?BegWX]`*,  MOjo  "#&#'#$$|%}%&&N'O'_(`( )@)Q)S)3*5***++++T,V,----c.e.)/+///00a1c1~2222334455O6Q677T8V888T9V9#:%:::;;<<b=d=!>#>>>??lAnA%B'BBBCCDDEEMFOFGGGGHHIIvJxJJJKKLL?MAMMMOOOO}PPQQRRVSXS9T;TUUVVZW\WWWXXXX[[d^f^``ZcccddddieeTf^fqfjPlSlVeterinarski fakultet.C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of BENIC.asdVeterinarski fakultet.C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of BENIC.asdVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCVeterinarski fakultet$C:\My Documents\magisterij\BENIC.DOCmr*o C  }  w% M- i&0rE00 |+3 w3 Mch: B; %> I ? C ;G $H }AI 1*M`GZDNBpL` !.a _d@j .Pk qk >n  s`Hm`|Uu Hx kz jt hho(hh.hh.hh.hh. 0 o(.hho(-hh.hh.hh.hh.hh. hhOJQJo(hh. hhOJQJo(hh. hhOJQJo(hh. 88OJQJo(hho(hho(.hh.hh.hh.hh.hh.hho(hh. hhOJQJo(hho(.hh.`|UuC%>}AIqk0>njt;G!.a1*MM-kzI ?mr sZDNo C Hx.Pkw3w%_d@jL`i&0} Mch:$H|+3E0B;@HP LaserJet 1100LPT1:hpptaHP LaserJet 1100HP LaserJet 1100)Nw 4dXX210 x 297 mmHP LaserJet 1100LPT1:B  BRdHHP LaserJet 1100)Nw 4dXX210 x 297 mmHP LaserJet 1100LPT1:B  BRdH]j]j]jVj| %'(-36789<>?@FOP[cdfghijkrtuwrrrrrrrrrrrrrrr4444^^^^^^^^^^ ^ ^^^^^^^^!^"^(^)^*^+-.<='B'C G H\W\\\]\^\_\`\awbwcwdefRl@@@@@@@@@ @&@(@0@2@:@<@N@R@T@^@j@@@r@t@v@|@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@ @ @@@@@"@&@.@2@4@F@P@@@T@V@X@Z@^@d@h@p@x@@@@@@@$@@@@@P@@@@@l@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@$@&@0@6@:@@@B@N@@@R@@@V@@@f@@@n@@@t@@@@@@@@@4@@@@@@@@H@GTimes New Roman5Symbol3& ArialG& Arial CROArial" hJ,f]