Naslov
Metil-transferaza ErmC': kloniranje i ekspresija gena i pročišćavanje proteina
(Methyltransferase ErmC': gene cloning and expression and protein purification)

Autori
Maravić, Gordana

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, magistarski rad

Fakultet
Prirodoslovno-matematički fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
14.04

Godina
2000

Stranica
87

Mentor
Flögel, Mirna

Ključne riječi
ErmC'; ekspresija; kloniranje; MLS antibiotici; otpornost; pročišćavanje
(cloning; ErmC'; expression; MLS antibiotics; purification; resistance)

Sažetak
Bakterijska rezistencija na antibiotike skupine makrolid-linkozamid-streptogramin B temelji se na djelovanju niza metil-transferaza iz obitelji Erm koje jednostrukom ili dvostrukom metilacijom specifičnog adenina unutar 23 S rRNA sprečavaju vezanje antibiotika na ribosom. Za istraživanje je odabrana metil-transferaza ErmC’, jedan od biokemijski stabilnijih pripadnika Erm skupine enzima. Gen ermC’ izoliran je i umnožen iz prirodnog plazmida pIM13 bakterije Bacillus subtilis BD1167 u lančanoj reakciji polimerazom. Istovremeno su na krajeve gena uvedena restrikcijska mjesta koja su omogućila njegovo kloniranje u ekspresijski vektor pET-25b(+). Rekombinantni vektor pET-25b(+)/ermC’ unijet je u ekspresijski soj E. coli BL21(DE3)pLysS. Ekspresija proteina potaknuta je dodatkom IPTG u bakterijsku kulturu i optimirana tako da udio topljivog proteina bude što veći. Iskušavanjem niza kromatografskih metoda utvrđen je optimalni postupak pročišćavanja metil-transferaze ErmC’ iz proteinskog ekstrakta bakterija. Metoda uključuje dva koraka pročišćavanja na kationskom izmjenjivaču pri čemu je protein u prvom koraku eluiran stupnjevitim koncentracijskim gradijentom NaCl, a u drugom linearnim koncentracijskim gradijentom NaCl. Opisanim postupkom dobiva se protein vrlo visoke čistoće uz dobru učinkovitost. Raspravljena su buduća istraživanja od kojih se očekuje rasvjetljavanje katalitičkog djelovanja i strukture aktivnog centra metil-transferaze ErmC’.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biologija

POVEZANOST RADA