Naslov
Učinak naltreksona na aktivacijsko stanje BV-2 mikroglija stanica
(Effect of naltrexone on the activation state of BV-2 microglia cells)

Autori
Grahovac, Irena

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, postdiplomski specijalisticki

Fakultet
Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
24.01

Godina
2019

Stranica
35

Mentor
Bach-Rojecky, Lidija

Neposredni voditelj
Kučić, Natalija

Ključne riječi
mikroglija stanice, in vitro, naltrekson, protočna citometrija
(microglia cells, in vitro, naltrexone, flow cytometry)

Sažetak
Polazeći od hipoteze da je aktivirajuće polarizacijsko stanje (M1/M2) mikroglija stanica odgovorno za ishod bolesti središnjeg živčanog sustava (SŽS) koji u svojoj patofiziološkoj osnovi imaju upalnu komponentu, cilj ovog rada bio je istražiti potencijalno modulatorno djelovanje opioidnog antagonista naltreksona na mikrogliju u in vitro uvjetima. Specifični cilj rada bio je ispitati protuupalne učinke niskih doza naltreksona na promjenu imuno-metaboličkog profila BV-2 stanične linije mikroglije i njihovo prevođenje iz aktiviranog u mirujući imuno(neuro)protektivni fenotip. Materijali i metode Istraživanje je provedeno u in vitro uvjetima na modelu imortaliziranih BV-2 mikroglija stanica kultiviranih u standardnim uvjetima DMEM medija uz dodatak 10% FCS-a i bez dodatka FCS-a čime je postignut odgovarajući stanični fenotip kao polazište za testiranje lijeka. Promjene u morfologiji BV-2 mikroglija stanica praćene su pomoću svjetlosnog mikroskopa, a proteinski izražaj biljega M1 (iNOS) i M2 (CD206) aktivacijskog stanja metodom imunofluorescencije na staklu. Protočnom citometrijom praćen je površinski izražaj imunoloških molekula CD86, CD16/32, CD206, MHC I/II). Metaboličke promjene u stanici procjenjene su na temelju mjerenja glikolitičke aktivnosti i potrošnje kisika Seahorse metodom. Rezultati Nakon standardnog uzgoja BV-2 mikroglija stanica u DMEM mediju uz dodatak 10% FCS-a (BV-210%FCS) zapažen je pretežito ameboidan oblik. Oduzimanjem FCS-a iz medija za uzgoj, BV-2 (BV-2øFCS) stanice počinju pružati izdanke poprimajući razgranatu morfologiju koja predstavlja obilježje mirujućih mikroglija stanica. U navedenim uvjetima visoki izražaj iNOS-a obilježje je aktiviranih ameboidnih BV-210%FCS stanica dok izražaj istog opada u razgranatim mirujućim BV-2øFCS stanicama uz upravo obrnuti obrazac izražaja molekule CD206 na temelju čega je iNOSpoz CD206neg aktivirajući stanični fenotip M1 profila združen sa BV-210%FCS, a iNOSnegCD206poz mirujući stanični fenotip M2 profila sa BV-2øFCS. Pretpostavljeno protuupalno svojstvo naltreksona testirali smo na prethodno inducirajućem aktiviranom fenotipu BV-210%FCS (iNOSpoz CD206neg) primjenjujući niske koncentracije u rasponu 10-50-100-250 μM naltreksona. Koncentracija 100 μM naltreksona pokazala se najučinkovitija u postizanju mirujućeg staničnog fenotipa (iNOSneg CD206poz). Istovremeno, izražaj površinskih imunoloških molekula CD86, CD16/32 nije se značajnije mijenjao što upućuje na slabo imunomodulacijsko svojstvo naltreksona spregnuto sa zbivanjima na staničnoj površini. Polazeći od koncepta prema kojem se M1/M2 polarizacijski profil veže uz energetski i metabolički status stanice, metaboličke promjene u stanici primjenom naltreksona pratili smo Seahorse metodom mjereći glikolitičku aktivnost i potrošnju kisika. Rezultati potvrđuju da su BV-210%FCS stanice metabolički aktivne dok su BV-2øFCS mirujuće i energetski neaktivne. Koristeći FCS, LPS i IFN-ƴ kao induktore metaboličnog reprogramiranja, koji stanicu aktiviraju konfigurirajući je u odgovarajući metabolički fenotip, potvrdili smo LPS kao induktora aerobnog metabolizma, a IFN-ƴ kao čimbenika porasta anaerobnog metabolizma. Naltrekson je smanjio energetsku aktivnost stanice inducirane LPS-om te izrazito smanjio anaerobni metabolizam u stanicama aktiviranih s IFN-ƴ čime se naltrekson dodatno potvrđuje kao lijek koji djeluje na uspostavi ravnoteže staničnog metabolizma vodeći hiperaktivirane stanice u hipoenergetsko stanje. Zaključci Naltrekson u koncentraciji od 100 μM dovodi do pretvorbe staničnog fenotipa BV-2 mikroglija stanica iz aktiviranog (iNOSpoz CD206neg) u mirujući (iNOSneg CD206poz) fenotip. Naltrekson ne pokazuje imunomodulacijski učinak na aktivirane BV-2 mikroglija stanice budući da ne mijenja izražaj površinskih staničnih molekula (CD86, CD16/32, CD206, MHC molekula I i II razreda). Naltrekson uspostavlja ravnotežu staničnog metabolizma dovodeći BV-2 mikroglija stanice iz hiperaktiviranog (inducirane s FCS, LPS, IFN-ƴ) u hipoenergetsko stanje.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Farmacija

POVEZANOST RADA