Naslov
Gensko obilježavanje i praćenje diferencijacije ljudskih kardiomiocita
(Genetic Labeling and Differentiation Monitoring of Human Cardiomyocytes)

Autori
Šepac, Ana ; Bosnjak, ZJ ; Seiwerth, S ; Sedlić, F

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Radovi u zbornicima skupova, cjeloviti rad (in extenso), znanstveni

Izvornik
Molekularna genetika - novosti u dijagnostici i terapiji / - , 2017, 126-136

Skup
Molekularna genetika - novosti u dijagnostici i terapiji

Mjesto i datum
Zagreb, Hrvatska, 16.10.2017

Vrsta sudjelovanja
Pozvano predavanje

Vrsta recenzije
Domaća recenzija

Ključne riječi
genski biljezi ; kardiomiogeneza ; diferencijacija ; pluripotentne matične stanice ; kardiomiociti
(genetic markers ; cardiomyogenesis ; differentiation ; pluripotent stem cells ; cardiomyocytes)

Sažetak
Srčano zatajivanje se ubraja među vodeće uzroke smrti u razvijenim zemljama. Obećavajući eksperimentalni pristupi uključuju poticanje regeneracije srca transplantiranim matičnim stanicama ili poticanje diobe i umnažanja postojećih kardiomiocita. Unatoč nedovoljno ohrabrujućim rezultatima pojedinih kliničkih studija, prvenstveno baziranih na terapiji matičnim stanicama, znanstveno-klinički interes za razvijanjem i poboljšanjem ovakvih potencijalnih terapijskih pristupa ne jenjava. Naš rad uključuje izradu i primjenu genskih biljega za obilježavanje i praćenje živih kardiomiocita diferenciranih iz matičnih stanica, te istraživanje genskih biljega koji omogućuju promatranje napredovanja kardiomiogene diferencijacije. Usmjerena, in vitro kardiomiogena diferencijacija pluripotentnih matičnih stanica je postignuta primjenom kombinacije čimbenika rasta, aktivina A (50 ng/ml) i koštanog morfogenetskog proteina-4 (10 ng/ml) u RPMI/B27 staničnom mediju. Pojava sveobuhvatnih područja spontanih i ritmičnih kontrakcija upućivala je na nazočnost diferenciranih kardiomiocita, što je potvrđeno različitim metodama detekcije izražaja gena i elektrofiziološkim metodama. Praćenje živih kardiomiocita nakon in vitro diferencijacije omogućila nam je izrada lentivirusnog vektora koji je posredovao prijenos reporterskog gena za pojačani zeleni fluorescentni protein koji je bio pod transkripcijskom kontrolom promotora gena lakog lanca miozina-2v. Vektor je proizveden podkloniranjem reporterskog konstrukta u lentivirusni transfer plazmid pHR(+)c.Ub.MCSoligo.R(-)W(+). Primjenom ovog načina označavanja kardiomiocita potvrđena je visoka učinkovitost kardiomiogene diferencijacije, koja iznosi 65-85%, ovisno o staničnoj liniji, uz učinkovitost transdukcije od 98%. Sam tijek in vitro diferencijacije različitih pluripotentnih staničnih linija je praćen uz pomoć kvantitativnog PCR-a, pri čemu je određivan izražaj skupa gena karakterističnih za pojedine stadije kardiomiogeneze, i to: OCT4 (genski biljeg pluripotentnosti), brachyury (T ; biljeg mezendoderma), MESP1, NKX2.5 i ISL1 (biljezi rane faze indukcije kardiomiogeneze), GATA4, MEF2C, TNNT2 i MYL7 (biljezi kasne faze diferencijacije) te HCN4, SCN5A, CACNA1C, KCNH2, KCNJ2 i KCND3 (ionski kanali u kardiomiocitima). Analizom je utvrđeno da se vremenski obrazac izražaja ovih genskih biljega podudara s pojedinim fazama kardiomiogene diferencijacije. U zaključku, primjena ovih pristupa genskog obilježavanja kardiomiocita predstavlja platformu za razvoj znanstveno-dijagnostičkih pomagala uz pomoć kojih bi se mogla pratiti terapijska regeneracija srca koju bismo mogli očekivati u budućnosti.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Temeljne medicinske znanosti, Kliničke medicinske znanosti, Biotehnologija u biomedicini (prirodno područje, biomedicina i zdravstvo, biotehničko područje)

POVEZANOST RADA