Naslov
Metodologija CRISPR/Cas i njezina primjena u dijagnostici
(CRISPR/Cas methodology and its application in diagnostics)

Autori
Sumpor, Daniel

Vrsta, podvrsta i kategorija rada
Ocjenski radovi, postdiplomski specijalisticki

Fakultet
Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Mjesto
Zagreb

Datum
29.09

Godina
2021

Stranica
70

Mentor
Dabelić, Sanja

Ključne riječi
CRISPR/Cas metodologija, dijagnostika
(CRISPR/Cas methodology, diagnostics)

Sažetak
CILJ ISTRAŽIVANJA: Cilj istraživanja je sažeto prikazati primjene metodologije CRISPR/Cas u biomedicini i dijagnostici te dati detaljan pregled trenutno postojećih dijagnostičkih platformi temeljenih na CRISPR/Cas sustavu, kao i dijagnostičkih platformi koje su još u fazi razvoja. Hipoteze istraživanja su: 1. Metodologija CRISPR/Cas osim široke primjene temeljene na mogućnosti uređivanja genoma ima i velik dijagnostički potencijal. 2. Dijagnostičke platforme temeljene na metodologiji CRIPSR/Cas u uznapredovaloj su fazi i izgledno je da će u vrlo bliskoj budućnosti biti u široj uporabi za dijagnostiku zaraznih bolesti. 3. Daljnji razvoj metodologije CRISPR/Cas za dijagnostičke svrhe vjerojatno će dovesti do stvaranja dijagnostičkog alata koji će biti jednako kvalitetna alternativa dijagnostičkoj primjeni lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu (real-time PCR). MATERIJAL I METODE: U ovom radu objašnjen je princip funkcioniranja sustava CRISPR/Cas čije je otkriće najprije kao dijela obrambenog sustava prokariota dovelo do razvoja moćnog alata za gensko uređivanje i gensku terapiju te u novije vrijeme kao osjetljive i specifične metodologije za primjenu u dijagnostici. Ovim radom predočena je primjena sustava CRISPR/Cas klase 2 u različitim područjima biomedicine i dijagnostike za koje je karakteristično kidanje ciljnih i kolateralnih molekula DNA i RNA jednim efektorskim proteinom Cas, što je karakteristika koja je omogućila izradu jednostavnih, a pritom visoko osjetljivih i specifičnih platformi za dijagnostiku različitih bolesti, posebno onih koje su uzrokovane virusnim infekcijama. U radu su objašnjene i uspoređene trenutno najrazvijenije platforme temeljene na CRISPR/Cas detekcijskom sustavu II. tipa (CRISPR-Chip), detekcijskom sustavu V. tipa (DETECTR, HOLMES, HOLMESv2, STOPCovid) te detekcijskom sustavu VI. tipa (SHERLOCK, SHERLOCKv2, CARMEN) pri čemu opisane platforme u kombinaciji s drugim metodama poput potenciometrije ili umnažanja nukleinskih kiselina i korištenja različitih tehnika za vizualizaciju rezultata mogu detektirati iznimno niske koncentracije bakterijskih i virusnih patogena (između 10 -15 M i 10 -21 M). REZULTATI: Međusobnom usporedbom mehanizama djelovanja te rezultata osjetljivosti i specifičnosti detekcije DNA i RNA na različitim modelnim organizmima, mogu se uočiti rezultati detekcije iznimno niskih koncentracija ciljnih molekula od interesa te jednostavnost izrade i velik potencijal opisanih platformi za razvoj u dijagnostičke alate za rutinsku primjenu. Niske vrijednosti detekcije ciljnih molekula od 10 -15 M do 10 -21 M pokazuju perspektivu za uvođenje opisane metodologije u rutinsku dijagnostiku u bliskoj budućnosti i pružanje kvalitetne alternative metodi real-time PCR koja se u molekularnoj dijagnostici uvriježila kao zlatni standard. Neke od opisanih metodologija, poput primjerice metode SHERLOCK, već su VI odobrene za rutinsku primjenu u dijagnostici virusa SARS-CoV-2 u jeku borbe protiv aktualne pandemije Covid-19. Predloženo istraživanje pruža izvor informacija za istraživanje i usporedbu drugih dijagnostičkih alata sa sličnom primjenom. ZAKLJUČCI: Metodologija CRISPR/Cas trenutno prolazi kroz strelovit razvoj u nove dijagnostičke platforme za detekciju ciljnih molekula visoke osjetljivosti i specifičnosti, čijem je razvoju uvelike pridonijela globalna pandemija uzrokovana virusom SARS-CoV-2. Najrazvijenije dijagnostičke metode temeljene na sustavu CRISPR/Cas opisane u ovom radu (CRISPR-Chip, DETECTR, HOLMES, HOLMESv2, STOPCovid, SHERLOCK, SHERLOCKv2 i CARMEN) predstavljaju novu realnost molekularne dijagnostike te u potpunosti pružaju alternativu dijagnostičkom testiranju putem metode real-time PCR. Metodologija CRISPR/Cas pogodna je za primjenu u laboratorijima ili dijelovima svijeta s ograničenim resursima te za razvoj prijenosnih dijagnostičkih instrumenata i testova za testiranje na mjestu pružanja zdravstvene skrbi (engl. point-of-care testing). Identifikacijom novih ortologa proteina Cas koji pokazuju poboljšana svojstva u odnosu na poznate i već korištene proteine Cas u sustavima CRISPR/Cas otvorit će put ka razvoju novih dijagnostičkih platformi temeljenih na ovoj revolucionarnoj metodologiji, čiju ćemo upotrebu moći sve češće vidjeti u kliničkoj upotrebi u bliskoj budućnosti.

Izvorni jezik
Hrvatski

Znanstvena područja
Biologija, Temeljne medicinske znanosti, Farmacija, Biotehnologija u biomedicini (prirodno područje, biomedicina i zdravstvo, biotehničko područje)

POVEZANOST RADA