ࡱ> 7 PbjbjUU *7|7|^lbbbb    , $k,(\ \ \ \ \ ; ; ; *******$- /*}; 7 ; ; ; *bb\ \ %,; 4b8\ \ *; *0k(n*\ P ï:fR o H)(n*;,0k,"*LG0G0n*bbbbPRIMJENA ASISTIRANE REPRODUKCIJE U HRVATSKOJ VETERINARSKOJ MEDICINI Z. Makek Laboratorij za asistiranu reprodukciju Klinike za porodniatvo i reprodukciju, Veterinarski fakultet Sveu iliata u Zagrebu SA}ETAK Usvajanje i primjena postupaka asistirane reprodukcije u rasploivanju domaih ~ivotinja ima dalekose~ne posljedice u komercijalnom uzgoju stoke. Umjetno osjemenjivanje, embriotransfer, oplodnja i uzgoj in vitro, seksiranje sperme i zametaka, transgeneza i kloniranje sustavno se primjenjuju u uzgojnim programima diljem svijeta omoguavajui brzi genetski napredak stada. Republika Hrvatska joa uvijek u~iva status zemlje slobodne od danas najopasnijih sto nih zaraza, ato je prednost koju svakako moramo iskoristiti za stvaranje mati nih stada domaeg simentalskog goveda. No, potrebna je sustavna, kontrolirana i kompetentna primjena dostupnih tehnologija da bi se postigao ~eljeni cilj. Laboratorij za asistiranu reprodukciju Klinike za porodniatvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta u Zagrebu, u suradnji sa Laboratorijem za spermatologiju Centra za reprodukciju u sto arstvu Hrvatske d.o.o. i Klinke, predstavljaju jezgru koja omoguava primjenu suvremenih biotehnoloakih metoda u naaoj sto arskoj proizvodnji. Va~no je naglasiti da su ~ivotinje u postupcima asistirane reprodukcije pod strogom sanitarnom kontrolom ime je mogunost prijenosa bolesti svedena na najmanju moguu mjeru. Prema tome, ne samo da imamo mogunost odabira i airenja genoma najkvalitetnijih ~ivotinja, nego imamo mogunost kontrole zdravlja ~ivotinja i ljudi te dobivanja kona nog proizvoda slobodnog od aktualnih sto nih zaraza. SUMMARY The application of assisted reproductive technology (ART) in stockbreeding has tremendously changed the genetic improvement rates in breeding programs and strategies. Techniques such as AI, embryo transfer, in vitro production of embryos, sperm and embryo sexing, transgenesis and cloning are consistently used in cattle breeding schemes and genetic improvement programs allround the word. The Republic of Croatia is still free from the highly risk infectios diseases and this facts must be used for our advantage. Nucleus herds of native Simmental cattle should be formed and used for propagation of the advantageous genetics for milk and meet production. Howevwe, a systematic, controlled and competent use of the available technologies is required in order to gain desired objectives. The Laboratory for Assisted Reproduction at the Clinic for Obstetrics and Reproduction of the Veterinary Faculty University in Zagreb, along with the Laboratory for Spermatology of the Center for reproduction and animal breeding of Croatia d.o.o and this Clinic, respresents the nucleus unit for application of modern embryo technologies in our stock breeding shemes. The animals submitted to assisted reproduction procedures are under strict sanitary control what ensure the minimum risk for transmition of pathogenic agents. Considering all this facts, not only that we facilitate genetic improvement in the cattle industry by obtaining a large number of calves from cattle of high genetic quality, but we also have the opportunity to control health of the animals and indirectly of humans by producing the final product free from infectious diseases. Dvadeset i prvo stoljee s pravom se naziva stoljee biotehnologije: razotkrivanje karte ljudskog genoma omoguiti e prevenciju i lije enje nekih nasljednih bolesti, mogunost kloniranja viaih sisavaca i ljudi postala je stvarnost, genetski preina ene biljke otporne na parazite ili viruse donose velike prinose za rastuu ljudsku populaciju, a iz mlijeka genetski modificiranih krava proizvode se ljudski proteini za potrebe farmaceutske industrije. Pojava BSA i epidemija slinavke i aapa dovela je do velike reorganizacije komercijalnog uzgoja stoke, osobito u Evropi. Osim toga prisutan je openito negativan stav prema biotehnoloakim proizvodima te je stoga vrlo va~no pokazati stvarnu ulogu i vrijednosti ovih biotehnologija (Galli i sur., 2003). Usvajanje i primjena postupaka asistirane reprodukcije u rasploivanju domaih ~ivotinja imaju dalekose~ne posljedice u komercijalnom uzgoju stoke, jer nam omoguavaju kontrolirani utjecaj na genetsku selekciju, airenjem po~eljne genetike prema ~eljenim proizvodnim svojstvima. Stoga je uklju ivanje ovih tehnologija neophodno za odreivanje smjernica uzgojnih programa. Umjetno osjemenjivanje (U.O.) pripada prvoj generaciji metoda asistirane reprodukcije koja se ve viae od 50 godina primjenjuje u sto arstvu, s najveim u inkom na genetski napredak stada airenjem genoma najkvalitetnijih rasplodnjaka, spre avanjem airenja spolno prenosivih bolesti te omoguavajui relativno jednostavni prijenos i trgovinu genetskim materijalom. U Hrvatskoj je prvo uspjeano U.O. krava obavljeno 1943. god., ato je potvreno zahvalnicom sto ara iz Remeta nakon poroda te krave prof. dr. sc. Bo~idaru Okljeai, predstojniku Porodiljske klinike (`ic, 1989). Sustavni podaci o umjetnom osjemenjivanju postoje tek od 1948. godine od kada mo~emo pratiti rad i rezultate u suzbijanju i lije enju neplodnosti krava i junica te iskoriatavanju bikova. Umjetno osjemenjivanje odigralo je va~nu ulogu u iskorjenjivanju spolnih zaraza: bruceloze, trihomonijaze i durine u razdoblju poslije drugog svjetskog rata (Herak i sur., 1998). Osim bi jeg sjemena uspjeano je zamrznuto i sjeme nerastova (Herak i sur., 1980; Premzl i sur., 1983), pastuha (Sukali, 1981, Vitkovi i Geceg, 2000), jar eva (Premzl i sur., 1986) te ovnova (Petri i sur., 2001). Na ~alost, u praksi se kod nas koristi samo DS sjeme bikova i jar eva. Novija istra~ivanja dovela su do primjene laparoskopske intrauterine inseminacije ovaca DS sjemenom ovnova (Petri i sur., 2001), jer je do tada primjenjivana klasi na metoda umjetnog osjemenjivanja u cerviks sa DS spermom ovnova davala nesigurne razultate. `to se ti e obuhvata umjetnim osjemenjivanjem, on se popravio poslije domovinskog rata na viae od 75% osjemenjenih krava. Svinje imaju obuhvat oko 15% kod individualnih dr~aoca i to uglavnom u sjeverozapadnoj Hrvatskoj i Slavoniji, a mnogo su manje obuhvaena ostala podru ja (Herak i sur., 1998.). U velikim uzgojima svinje se osjemenjuju u viae od 90% slu ajeva razrijeenom spermom nerasta. S ovim brojkama joa uvijek ne mo~emo biti zadovoljni jer su one joa ispod svjetskog prosjeka. Danas se u svijetu proizvede 232 milijuna doza u preko 600 centara za U.O., a obuhvat umjetnim osjemenjivanjem iznosi od 90% do 100% (Vishwanath, 2003). U Hrvatskoj danas postoje tri centra za U.O. i to u Kri~evcima u okviru Centra za reprodukciju u sto arstvu Hrvatske d.o.o. (CRSH), Osijeku u okviru Zavoda za unapreenje sto arstva te u Slavonskom Brodu u okviru veterinarske stanice. Centri raspola~u suvremenom aparaturom za ocjenu, razrjeivanje i konzerviranje DS sperme bikova. Posljednjih se godina prelazi s midipajeta koje su u nas u upotrebi (0,5 ml razjeenog sjemena) na minipajete od 0,25 ml (Premzl i sur., 1995.). Plotkinje se uglavnom osjemenjuju na gospodarstvima, na poziv vlasnika, a sve manje na punktovima za U.O.. Tijekom 2002. godine otvoren je zajedni ki Laboratorij za spermatologiju Centra za reprodukciju u sto arstvu Hrvatske d.o.o. i Klinike za porodniatvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta koji raspola~e suvremenom opremom za analizu i kontrolu kvatitete sjemena rasplodnjaka. Uvode se nove metode ocjene statusa membrane (HOS test, SYBR 14/PI) i akrosome spermija (Trypan Blue / Giemsa, PSA-FITC), a u suradnji s Laboratorijem za asistiranu reprodukciju Klinike za porodnitvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta procjenjuju se i razli ite metode pripreme bi je sperme za opdnju in vitro. Embriotransfer (MOET = multipla ovulacija i embriotransfer) je metoda asistirane reprodukcije koja se ve skoro 30 godina sustavno koristi kod goveda, malih pre~iva a, konja te divlja i, za genetsko poboljaanje stada i proizvodnju velikog broja potomaka od najkvalitetnijih ~enskih ~ivotinja. Ekonomske prednosti primjene embriotransfera uklju uju: ubrzanje genetskog napretka stada proizvodnjom velikog broja potomstva od elitnih plotkinja, mogunost meunarodnog transporta i trgovine duboko zamrznutim zamecima ime se smanjuje potreba dugotrajnog transporta i aklimatizacije ~ivih ~ivotinja, o uvanje ugro~enih pasmina i vrsta te primjenu drugih metoda asistrane reprodukcije kao ato je cijepanje zametaka i bli~njenje te odreivanje spola zametaka (Gordon, 1996.). U Hrvatskoj je embriotransfer prvi puta primjenjen u svinja tijekom 1985./86. godine u okviru meunarodnog projekta Klinike za porodniatvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta u Zagrebu  Mogunost prijenosa viroza u svinja embriotransferom , glavnog istra~iva a prof. dr. sc. Miroslava Heraka. Izvraen je operativni embriotransfer iz 14 davateljica u 8 primateljica s vrlo dobrim uspjehom. Stru njaci Veterinarske stanice Vara~din u suradnji sa stru nom grupom Besammungsverina Neustadt /Aisch uspjeano su 1986. Godine transferirali u sinkronizirane junice duboko smrznute zametke, koje je ta stru na grupa donijela iz Neustadt / Aischa (Makek, 1994). Rupi i sur. (1990) istra~ili su utjecaj kirurake i prirodne inseminacije kod embriotransfera ovaca pasmine domaa pramenka. Sustavni rad na uvoenju i primjeni embriotransfera u rasploivanju goveda zapo inje 1992. godine osnivanjem Laboratorija za asistiranu reprodukciju pri Klinici za porodniatvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta Sveu iliata u Zagrebu, u okviru istra~ivanja na projektu Ministarstva znanosti i tehnologije (MZT) "Embriotransfer u krava" glavnog istra~iva a prof. dr. sc. Zdenka Makeka. Istra~eni su postupci superovulacije te superovulacijski odgovor u krava i junica (Makek i sur., 1994a; Makek i sur., 1994b; Makek i sur.; 1996a, Rudan i Maja `najder, 1996), postupak dubokog smrzavanja goveih zametaka te transfer u sinkronizirane primateljice (Makek i sur., 1994c, Makek i sur., 1997). Kao rezultat tih istra~ivanja i suradnje stru njaka Klinike za porodniatvo i reprodukciju Veterinarskog Fakulteta Sveu iliata u Zagrebu i CRSH uveden je postupak embriotransfera u naau veterinarsku medicinu te roeno prvo tele nakon uspjeanog embriotransfera u rujnu 1995. godine (Makek i sur., 1996b). Danas u Hrvatskoj djeluju dva tima za embriotransfer: jedan tim pri Klinici za porodniatvo i reprodukciju Veterinarskog Fakulteta u Zagrebu, financiran od MZT. Na temelju istra~ivanja i rada stru njaka Klinike, a uz potporu MZT, u okviru kolegija  Porodniatvo domaih ~ivotinja uveden je odlukom Fakultetskog Vijea seminar  Biotehnologija rasploivanja za studente VIII. semestra dodiplomske nastave, kako bi se budui veterinari upoznali i pripremili za primjenu postupaka asistirane reproduckije u praksi. Drugi ET tim djeluje u okviru CRSH i financiran je od Ministarstva poljoprivrede i aumarstva preko VIP projekta  Primjena embriotransfera u rasploivanju goveda , glavnog istra~iva a dr. sc. Maria Matkovia. Oba tima usko surauju, a cilj ovih projekata je uspostavljanje terenske slu~be koja e rutinski provoditi MOET tehnologiju na terenu u suradnji s drugim stru nim slu~bama: Hrvatskim sto arsko selekcijskim centrom (HSSC), Hrvatskom sto arsko savjetodavnom slu~bom (HSSS), Hrvatskim veterinarskim institutom (HVI), veterinarskim stanicama i Agronomskim fakultetom Sveu iliata u Zagrebu. Proizvodnja zametaka in vitro (IVP) predstavlja treu generaciju postupaka asistirane reprodukcije, no ova tehnologija zahtijeva dobro opremljen laboratorij te dobro obu eno visokokvalificirano osoblje. Priozvodnja zametaka in vitro uklju uje polu ivanje goveih jajnih stanica od ~ivih krava davateljica ili iz klaoni kog materijala, te njihovo dozrijevanje (IVM), oplodnju (IVF) i uzgoj (IVC) in vitro. Razvoj ove biotehnologije ima fantasti ne potencijale kako za temeljna istra~ivanja tako i za njihovu primjenu u komercijalnom uzgoju stoke i genetski napredak stada. Osim toga omoguuje razvoj drugih biotehnologija kao ato su kloniranje i proizvodnja transgenih ~ivotinja (Hoshi, 2003). U govedarstvu IVP ima brojne primjene kao ato su: zaobila~enje nepredvidivog superovulacijskog odgovora i nekih poremeaja u spolnim organima davateljica (Sirard, 1989), proizvodnja zametaka iz jajnih stanica dobivenih ultrazvu nom punkcijom jajnika (Bols, 1997) ili laparoskopski (Besenfelder i sur. 1999), kontrola i spre avanje airenja zaraznih bolesti (Stringfellow i Givens, 2000), skraenje generacijskog intervala proizvodnjom zametaka od ~enske teladi prije puberteta (Duby i sur., 1996), dobivanje tovne teladi transferom zametaka u mlije ne krave (Van Soom i de Kruif, 1996), dijeljenje zametaka u svrhu dobivanja blizanaca (Pugh i sur., 1994), utvrivanje plodnosti bikova koji se koriste za U.O. i ubrzanje postupka progenog testiranja bikova (Marquant-Le Guienne i sur., 1992), te kona no proizvodnja transgenih ~ivotinja i kloniranje (Murray, 1999). Slijedei svjetske smjernice u podru ju biotehnologije rasploivanja, a u svrhu ato br~eg genetskog napretka govedarstva Republike Hrvatske, u Laboratoriju za asistiranu reprodukciju zapo eli smo 1997. godine istra~ivanja oplodnje i uzgoja in vitro goveih zametaka, u okviru projekta Ministarstva znanosti i tehnologije, glavnog istra~iva a prof. dr. sc. Zdenka Makeka. Postavljen je standardni protokol za dozrijevanje, oplodnju i uzgoj goveih zametaka in vitro (Makek i sur., 1998., Getz, 1999). Zameci proizvedeni in vitro kvalitetom odgovaraju standardima Meunarodnog druatva za embriotransfer (IETS) te su pogodni za transfer ili krioprezervaciju (Makek, 2001). Rezultati oplodnje i uzgoja in vitro u nizu uzastupnih pokusa ujedna eni su i u skladu su sa rezultatima koje posti~u drugi svjetski laboratoriji (Matkovi i sur., 2001; Getz i sur., 2001; Matkovi i sur., 2002). Nakon transfera in vitro proizvedenih zametaka u primateljice oteljeno je prvo IVP tele u Republici Hrvatskoj u travnju 2001. Godine (Makek, 2001). In vitro su oploene i uzgojene jajne stanice ~ivih krava davateljica dobivene transvaginalnom ultrazvu nom punkcijom jajnika stimuliranih (Getz i sur., 2002) ili krava u ciklusu (Getz i sur., 2001). Navedenim istra~ivanjima postavljeni su temelji za mogunost primjene i iskoriatavanja prednosti ove biotehnologije u naaoj sto arskoj proizvodnji. Osim toga istra~ujemo mogunosti primjene postupaka asistirane reprodukcije i u drugih ~ivotinjskih vrsta. U nastavku naaih istra~ivanja posebnu emo pa~nju obratiti na usavraavanje protokola proizvodnje in vitro goveih zametaka, transvaginalnu ultrazvu nu punkciju jajnika kao metodu dobivanja jajnih stanica iz visokovrijednih ~ivuih ~ivotinja, krioprezervaciju in vitro uzgojenih zametaka te ocjenu kvalitete in vitro dobivenih zametaka, kao i biopsiju zametaka uz pomo mikromanipulatora i odreivanje spola zametaka PCR tehnologijom. Takoer se po inje istra~ivati zna aj trofoblast proteina i leptina kao objektivnog dokaza postojanja ~ivog zametka ve 24. dana graviditeta (projekt MZT, glavnog istra~iva a prof.dr.sc. Antuna Tomaakovia), ime se omoguuje kvalitetna provjera uspjeha svih postupaka asistirane reprodukcije. Zaklju ak Primjena navedenih biotehnoloakih metoda nu~na je za uklju ivanje naae sto arske proizvodnje u meunarodne tijekove, pogotovo ulaskom Republike Hrvatske u WTO. Republika Hrvatska joa uvijek u~iva status zemlje slobodne od danas najopasnijih sto nih zaraza, ato je prednost koju svakako moramo iskoristiti za stvaranje mati nih stada domaeg simentalskog goveda. Koriatenjem po~eljnog genoma za proizvodnju mesa i mlijeka izravno se poti e airenje boljih proizvodnih svojstava ~ivotinja naae populacije ime ostaje o uvan status zdravog proizvoda. Usvajanje i primjena postupaka asistirane reprodukcije u rasploivanju domaih ~ivotinja imaju dalekose~ne posljedice u komercijalnom uzgoju stoke te je stoga uklju ivanje ovih tehnologija neophodno za odreivanje smjernica uzgojnih programa. No, potrebna je sustavna, kontrolirana i kompetentna primjena dostupnih tehnologija da bi se postigao ~eljeni cilj. Va~no je naglasiti da su ~ivotinje u postupcima asistirane reprodukcije pod strogom sanitarnom kontrolom ime je mogunost prijenosa bolesti svedena na najmanju moguu mjeru. Prema tome, ne samo da imamo mogunost odabira i airenja genoma najkvalitetnijih ~ivotinja, nego imamo mogunost kontrole zdravlja ~ivotinja i ljudi te dobivanja kona nog proizvoda slobodnog od aktualnih sto nih zaraza. Literatura Besenfelder U., Mlacher G., Brem G. (1999.): Oocyte Collection. Third Conference of the European Society for Domestic Animal Reproduction. Anger, November 26-27 1999. Reprod. in Dom. Animals. Supplement 6: 38-48. Bols P.E.J (1997.): Transvaginal Ovum Pick-Up in the cow: Technical and Biological Modifications. Doctoral thesis, University of Ghent, Belgium. Duby, R.T., P. Damiani, C.R. Looney, R.A. Fissore, J.M. Robl (1996.): Prepuberal calves as oocyte donors: promises and problems. Theriogenology 45, 121-130. Galli, C., R. Duchi, G. Crotti, P. Turini, N. Ponderato, S. Colleoni, I. Lagutina, G. Lazzari (2003): Bovine embryo technologies. Theriogenology 59 (2), 599-616. Getz Iva (1999): Dozrijevanje, oplodnja i uzgoj oploenih goveih jajnih stanica in vitro. Znanstveni magistarski rad. Veterinarski fakultet Sveu iliata u Zagrebu. Getz Iva, M. Matkovi, Z. Makek, M. Lojki, A. Tomaakovi, T. Karadjole (2001): In vitro developmental competence of embryos derived from transvaginal ultrasound oocyte aspiration in cycling cows and from slaughterhouse ovaries. ESDAR Newsletter 6 of the 5th Annual Conference of the European Society for Domestic Animal Reproduction. Vienna, 13-15. September 2001. (Abstract) Getz, Iva, M. Matkovi, M. Lojki, Z. Makek, G. Ba i, M. Cergolj (2000): Transvaginal ovum pick-up in the cow: alternative in the production of bovine embryos for tarnsfer. Vet. arhiv 70 (Suppl.), S75-S80.. Getz Iva, Matkovi Mario, Lojki Martina, Makek Zdenko, Tomaakovi Antun, Cergolj Marijan, Samard~ija Marko (2001): Transvaginal ultrasoun-guided oocyte collection in cyckling cows. Proceedings of the IIIrd Central European Buiatrics Congress "Health Problems in Ruminants", 24th and 25th May 2001, Czech Republic. 87-91. Gordon, I. (1996.): Controlled Reproducion in Cattle and Buffaloes. CAB International, Wallingford. Herak M., B. Premzl, Melita Herak (1980): Prva uspjeana osjemenjivanja krma a i nazimica sa spermom nerastova smrznutom vlastitom modifikacijom postupka dubokog smrzavanja. Vet. arhiv 50, 47-50. Herak, M., Z. Hrastnik, A. Gaapar (1998): Pedeset godina umjetnog osjemenjivanja domaih ~ivotinja u Hrvatskoj. Vet. stanica, 29 (2), 73-77. Hoshi, H. (2003): In vitro production of bovine embryos and their application for embryo transfer. Theriogenology 59 (2), 675-685. Matkovi, M., J. `urina, J. Petri, M. Lojki, Iva Getz, Z. Makek (2002): Comparison of some simmental sires for IVF: preliminary results. Theriogenology 51 (1), 677. Makek Z. (1994): Embriotransfer kao moderni postupak u suvremenom veterinarstvu. Vet. stanica 25 (6) 321-322. Makek, Z., D. Rudan, M. Herak, D. Vidu  (1996b): Roeno je prvo tele postupkom embriotransfera i Republici Hrvatskoj. Vet. stanica 27(3). 147-150. Makek, Z., Iva Getz, M. Cergolj, M. Herak, A. Tomaakovi, Korana Stipeti, T. Dobrani, V. Suai (1998): Selection of immature bovine oocytes as the preliminary phase of in vitro fertilization. Vet. arhiv 68 (3) 109-119. Makek, Z., M. Cergolj, Melita Herak, M. Herak, D. Rudan, K. Mihatovi, A. Tomaakovi, Iva Barac, T. Dobrani, Z. Tu ek (1994.c): Pokuaaji dubokog smrzavanja zametka goveda i uspjeh njihove transplantacije. Znan. prak. poljopr. tehnol. 24 (1) 204-208. Osijek. Makek, Z., M. Herak, M. Cergolj, D. Rudan, Melita Herak, Iva Barac-Getz, Z. Tu ek, Z. Biondi, K. Mihatovi (1994.a): Naaa iskustva s embriotransferom u goveda. Zbornik radova Veterinarski dani, Dubrovnik 1994. Makek, Z., M. Herak, M. Cergolj, D. Rudan, Melita Herak, Iva Barac-Getz, T. Vendl, Z. Tu ek, I. Cerove ki, K. Mihatovi, T. Dobrani (1994.b): Istra~ivanje uspjeanosti superovulacije i superovulacijskog odgovora, te broja dobivenih zametaka i rezultata njihovog transfera u krava i junica. Sto arstvo 48 (11-12) 435-442. Makek, Z., M. Herak, M. Cergolj, Iva Barac-Getz, D. Rudan (1996a): A comparison of rectal palpation and ultrasonography for the evaluation of superovulatory response on the ovaries in beef heifers. Acta Veterinaria Hungarica 44 (4). 467-476. Makek, Z.,M. Cergolj, Iva Getz, M. Herak, A. Tomaakovi, T. Dobrani (1997.): Embriotransfer u goveda. Praxis veterinaria 45, 153-159. Makek, Z., M. Matkovi, Iva Getz, M. Lojki (2000): In vitro production of bovine embryos for transfer: comparision between co-culture with granulosa cells and culture in defined medium. Vet. arhiv 70 (Suppl.), S105-S111. Makek Z., M. Matkovi, Iva Getz, Martina Lojki, A. Tomaakovi, T. Dobrani, M. Samard~ija, P. Bo~i, Z. Tu ek (2001): Oplodnjom in vitro za eto je i poroeno prvo tele u Republici Hrvatskoj. Zbornik radova  Veterinarski dani 2001. , Opatija, 17.-20. listopada 2001.; 101-103. Marquant le Guienne B., I P. Humblot (1992.): Tests de fertilit chez l,animal domestique par fcondation in vitro. Ann. Zootech. 41, 361-370. Matkovi, M., Petri, J., `urina, J., Lojki, M., Getz, Iva, Makek, Z. (2001): Simmental sperm separation protocols, evaluation for IVF. Proceedings of the 17th Scientific meeting of European Embryo Transfer Association. Lyon, 07.-08. September 2001., 150 (Abstract) Murray J.D. (1999.): Genetic modofications of animals in the next century. Theriogenology 51:149-159. Petri, J., M. Matkovi, Iva Getz, P. Bo~i, A. Tomaakovi (2001): Duboko smrzavanje sperme ovnova pasmine istarska pramenka  primjena za intrauterino osjemenjivanje. Zbornik radova  Veterinarski dani 2001. , Opatija, 17.-20. listopada 2001.; 98-100. Premzl, B., D. Vidu , M. Herak, Dubravka Dejanovi, P. Bo~i i Ivanka Maji (1995): Primjena duboko zamrznute sperme bikova u mini pajetama (0,25 ml) i rezultati umjetnog osjemnenjivanja u Hrvatskoj. Veterinarski dani '95 (Makarska, 9.-11. studenog 1995.) Zbornik radova. Zagreb (117). Premzl, B., Dubravka Dejanovi, Melita Herak, M. Herak, M. Torre, M. Sukali, P. Bo~i, Smiljka Selanec (1986): Utjecaj razli itih razrjeiva a i metoda dubokog zamrzavanja na kvalitet duboko zamrznute i kasnije otopljene sperme jarca. XI. savetovanje o dijagnostici, profilaksi i terapiji u savremenoj sto arskoj proizvodnji (Neum, 7.-10. oktobra 1986.). Zbornik kratkih sadr~aja. Beograd (37-38). Premzl, B., M. Herak, H. Pavuna, R. `ic, M. Sukali, M. Torre (1983): Procjena valjanosti duboko smrznute sperme nerastova s obzirom na promjene na akrosomima. Sto arstvo 37 (5-6), 219-221. Pugh, P.A., Thomson J.G., McGowan L.T., McMillan W.H., Tervit H.R. (1994.): In vitro production of cattle embryos: use in beef twinning programmes. U: Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production Vol 54: 351-352. Rudan, D., Maja najder (1996): Rezultati superovulacijskog odgovora u goveda primjenom pripravka "Metrodin". Vet. stanica 27 (5), 261-265. Sirard, M.A. (1989.): Practical aspects of in vitro fertilization in cattle. J. Reprod. Fertil. (Suppl.) 38: 127-134. Stringfellow, D.A., M.D. Givens (2000.): Infectious agents in bovine embryo production: hazards and solutions. Theriogenology 53 (1): 85-94. Sukali, M. (1981): Metodologija dubokog smrzavanja sperme ~drijebaca u slam icama od plasti ne mase. Doktorska disertacija. Veterinarski fakultet, Zagreb. `ic, Rudolf (1989.): Od zamisli do ostvarenja: 40 godina rada Sredianjeg zavoda za razmno~avanje i uzgoj domaih ~ivotinja. Sredianji zavod za razmno~avanje i uzgoj domaih ~ivotinja i ITRO "August Cesarec", Zagreb, 1989. Van Soom A., A. de Kruif (1996.): Oocyte maturation, sperm capacitation and pre-implantation development in the bovine: implications for in vitro production of embryos. Reprod. Dom. Anim. 31, 687-701. Vishwanath, R. (2003): Artificial insemination: the state of the art. Theriogenology 59 (2), 571-584. Vitkovi, A., I. Geceg (2000): Smrzavanje sjemena pastuha u Centru za reprodukciju u sto arstvu Hrvatske. Zbornik radova, Drugi hrvatski veterinarski kongres, Cavtat, 10.-12. listopada 2000., 257-260. BR6 ::B;<A8ABHW*\mHsH5\mHsHIB@ J,L15:::$a$$a$$a$$@&a$JN:@FWWW~\>cnttttx~~~~K݀z8$ & Fa$ & Fd & Fd$@&a$@& $@&`a$$h`ha$$`a$$a$:&vNҙܚȜ̡~/$ & Fa$ƜȜ<>ʡ̡\^~./dXJNP CJOJQJ CJmH$sH$CJH*mHsHCJH* CJmHsHCJfZJLNP$ & Fa$ (1h/ =!"#$% i8@8 NormalCJ_HaJmH sH tH H@H Heading 1$$@&a$5\aJmHsHu4@4 Heading 4$@&5CJ<A@< Default Paragraph Font`C` Body Text Indent$dhd[$`a$aJmHsHuJQ@J Body Text 3$dha$CJaJmH sH uBB@B Body Text$dha$aJmHsHuJY"J Document Map-D M OJQJ^J^^!EFPQ_`ai =>? ()*-!8$m,n,o,%/27,;-;.;8;[=M@N@O@Z@1AA`BCC EE3GG[HHkIJJKKLM OOPbQwRSTxTtUV!XXYOZZS[[\]]^^^000!000000000000a0a0a0a00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00000j=0j=0 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0 ^@ 0 ^@ 0 ^@ 0 ^@ 0 ^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0^@ 0 ^@ 0!^@ 0"^@ 0#^@ 0$^@ 0%^@ 0&^@0P^c:P_abdN`8@0(  B S  ?^OP ^^^^ !DhJ[\hjahb m ce;?  'u!w!{!7$8$%%%%'''(X([())$*'*g+i+o,:---.$/O3U3i4k444}555u6v66+7.7T777R8:::::*;8;;<<<Z===N>>W?Y?@@O@Y@Z@0AA_BSC\CCEEEGZH[HHHjIIIJJJKKKLLLLLL:OBOPPDQIQIRKR]RfRRRSSSSTTTwTxT UGUIU[UdUtUVV X!XXYNZS[[[\]]]^^^3333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333Getz.D:\My Documents\Iva\radovi\AS_REPROD_MAKEK.docGetzSC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of AS_REPROD_MAKEK.asdGetzSC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of AS_REPROD_MAKEK.asdGetzSC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of AS_REPROD_MAKEK.asdGetz.D:\My Documents\Iva\radovi\AS_REPROD_MAKEK.docGetzSC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of AS_REPROD_MAKEK.asdGetzSC:\WINDOWS\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of AS_REPROD_MAKEK.asd AsistentiA:\AS_REPROD_MAKEK.doc AdministratorAC:\Documents and Settings\All Users\Documents\AS_REPROD_MAKEK.doc AdministratorpC:\Documents and Settings\administrator\Application Data\Microsoft\Word\AutoRecovery save of AS_REPROD_MAKEK.asdR8L?4K~`   ,W>-$  - 21hL _d:  G+Ab(~J y)qQ Tz^ ` sIe,p g9o~ Q *hh^h`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L.hh^h`.^`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L. hh^h`OJQJo( hh^h`OJQJo(hh^h`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L. hh^h`OJQJo(hh^h`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L.hh^h`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L.hh^h`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L. hh^h`OJQJo(hh^h`.hh^h`.^`.pLp^p`L.@ @ ^@ `.^`.L^`L.^`.^`.PLP^P`L. hh^h`OJQJo( hh^h`OJQJo(hh^h`.+>-$Tz^ -g9o~p_d: 21~JsIe)qQQ~` `L? G+A+ @CJ OJQJo(l         Z@^@ Ԓ x !-47:@BC E G H I J O P Q R T U V X Y [ ]^@@$@@@,@0@p@@:@B@Z@h@n@t@@@@@@@@@@@4@@@@@@@@@\@@@UnknownGz Times New Roman5Symbol3& z Arial5& z!Tahoma;Wingdings"1hxFxFs $N($20d_  2Q$ASISTIRANA REPRODUKCIJA U HRVATSKOJ Getz AdministratorOh+'0 ,8 T ` l x%ASISTIRANA REPRODUKCIJA U HRVATSKOJ ft SISGetzIRAetzetzNormalAAdministratorRO3miMicrosoft Word 9.0C@e@K@59f@:f $N՜.+,0 hp   TibovitoA(_ %ASISTIRANA REPRODUKCIJA U HRVATSKOJ Title  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdeghijklmnopqrstuvwxyz{|}~Root Entry F@֯:f1TablefG0WordDocument*SummaryInformation(DocumentSummaryInformation8CompObjjObjectPool@֯:f@֯:f  FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.89q