ࡱ> @B?Y @bjbjWW L==]"""""""zzzzz z H J J J J J J $ n ]"n """"H 6"X"""""H 0b ""H  3(zz. ELEKTROFOREZA Osnovna na ela Elektroforeza je proces u kojemu otopljena tvar ili estica efektivnog naboja Q putuje u viskoznom puferu pod djelovanjem elektri nog polja prema jednoj od elektroda ovisno o prirodi njenog naboja. Sila putovanja koja djeluje na esticu koja putuje stalnom brzinom jednaka je otporu trenja, f, koji estica mora svladati u viskoznom puferu. X . Q = f gdje je X jakost elektri nog polja koja je jednaka omjeru izmeu napona E (V) i udaljenosti izmeu elektroda d (cm), a Q je naboj estice. U gelovima je otpor trenja slo~ena funkcija gustoe gela i veli ine estice. Elektroforetska pokretljivost ovisna je o brojnim initeljima kao ato su: veli na, oblik, koncentracija, elektri ni naboj, stupanj hidracije i disocijacije estice viskoznost, pH, temperatura i ionska jakost pufera jakost elektri ne struje i vrijeme putovanja Odnos izmeu elektroforetske pokretljivosti, brzine pokretljivosti, jakosti elektri nog polja, pH i ionske jakosti pufera jednako se odnosi i na slobodnu elektroforezu u viskoznom puferu i na zonsku elektroforezu. Zonska elektroforeza Zonska elektroforeza ozna ava putovanje nabijenih estica unutar granica vrstog elektroforetskog nosa a, a naziv je dobila po tome ato je svaka nabijena estica nakon odvajanja izolirana u pojedina nu zonu na elektroforetskom nosa u. Na elektroforetsku pokretljivost estice i oatrinu odvajanja djeluju razli iti initelji, ovisno i o vrsti elektroforetskog nosa a. To su: adsorpcija, nehomogenost i kapacitet elektroforetskog nosa a, elektroendoosmoza, protok pufera mostiima i dr. Zonska se elektroforeza provodi u elektroforetskoj kadi koja sadr~i dva puferska odjeljka spojena anodom i katodom. Kao izvor elektri ne struje slu~i ispravlja  niskog ili visokog napona. Dodatni dio, kod visokonaponskih elektroforeza, je plo a koju je mogue hladiti. U zonskoj elektroforezi koriste se razni nosa i kao ato su filtar papir, acetat celuloza, agar, agaroza, akrob i akrilamid. Filtar papir u elektroforezi slu~i jedino kao potporni elektroforetski nosa  koji ne prenosi toplinu i ima mali u inak na sam proces odvajanja nabijenih estica. Stoga se nabijene estice u takvom elektroforetskom nosa u odvajaju uglavnom prema gustoi naboja. Nasuprot tomu, agar, agaroza, akrob i akrilamid se odlikuju velikom viskoznoau i velikim otporom trenja. Oni, osim ato sprije avaju prijenos topline i smanjuju difuziju, aktivno sudjeluju u postupku odvajanja djelujui na elektroforetsku pokretljivost nabijenih estica, ato je ovisno o njihovoj veli ini. Rezultat ovog djelovanja je da se estice u agaru, agarozi, akrobu i akrilamidu odvajaju i prema gustoi naboja i prema veli ini. Svojstvo elektroforetskog nosa a da razlikuje molekule prema njihovoj veli ini pripisuje se njegovom kapacitetu prosijavanja zbog ega je ovaj u inak dobio naziv  u inak molekularnog prosijavanja . On nije jednako izra~en u svim vrstama elektrofretskih nosa a. Dok je neznatno izra~en u agaru, u akrobu i akrilamidu ima glavnu ulogu. Elektroforeza na acetat-celulozi Odvajanje nabijenih estica na acetat-celulozi takoer se osniva na razlici u gustoi naboja. Acetat-celuloza je elektroforetski nosa  glatke povraine i jedinstvene veli ine pora pa adsorpcija, elektroendoosmoza i protok pufera mostiima djeluju na odvajanje nabijenih estica u znatno manjoj mjeri nego kod nosa a poput filter papira, pa je i razdvajanje bolje. Acetat-celuloza nastaje obradom hidroksilnih skupina celuloze anhidridom octene kiseline. Svojstva elektroforetskog nosa a od acetat-celuloze ovisna su o stupnju acetilacije, postupku predpranja prigodom same izrade, vrsti aditiva, veli ini pora i debljini nosa a. Acetat-celuloza kao nosa  koristi se za elektroforetsko razdvajanje proteina u serumu, mokrai, likvoru kao i za razdvajanje razli itih varijanti hemoglobina. Elektroforeza proteina u serumu ja dobar test pretra~ivanja, prvenstveno za otkrivanje monokonskih proteina. Takoer je dobar pokazatelj funkcije jetre, bubrega i imunoloakog sustava. Po zavraetku elektroforeze razdvojene proteinske frakcije se oboje, suviaak boje ispere, trake u ine prozinima i denzitometrijski odredi relativni broj ani udio pojedinih proteinskih frakcija (slika 1.). Slika 1.: Elektroforeza proteina u serumu na acetat-celulozi : 1. slika monoklonske gamapatije 2. i 4. slike poliklonske hipergamaglobulinemije 3. slika normogamaglobulinemije Elektroforeza na akrilamidnom gelu (PAG, SDS-PAG) Akrilamidni gel je sli an agaroznom gelu ali sadr~i pore koje zbog svoje veli ine usporavaju elektroforetsku pokretljivost veih molekula. Zbog toga na odvajanje, osim gustoe naboja, djeluje i u inak  molekularnog prosijavanja . Obrada proteina s natrij-dodecilsulfatom (SDS) uklanja u inak elektri nog naboja na elektroforetsku pokretljivost. Kako se molekule bjelan evina i SDS ve~u u stalnom te~inskom odnosu, naboj po jedinici mase je stalan i elektroforetska pokretljivost postaje funkcija molekulske mase proteina. Tehnika SDS-PAGE u kombinaciji s vrlo osjetljivom metodom bojenja proteina srebrom omoguuje identifikaciju proteinskih frakcija u bioloakim tekuinama s niskim koncentracijama proteina (likvor, urin, suze), ali se isto tako mo~e koristiti u istra~iva ke svrhe (istra~ivanja proteinskog sastava homogenata tkiva i stanica, medija stani nih kultura i td. (slika 2.). Slika 2.: SDS elektroforeza proteina u mokrai uz bojenje srebrom Izoelektri no fokusiranje Izoelektri no fokusiranje (IEF) je elektroforetska tehnika u kojoj se odvajanje proteina provodi na osnovi razlike u njihovim elektroforetskim to kama. Izoelektri na to ka proteina jednaka je pH vrijednosti otopine kod koje su proteini elektri ki neutralni. Ona je ovisna o sastavu proteina i prema tome je fizikalno-kemijska konstanta za svaki protein. Kako je odnos aminokiselina i njihov broj razli it za svaki protein, raspon izoelektri nih to aka je vrlo airok. Elektroforeza se provodi u gelu poliakrilamida u kojem je prethodno uspostavljen postojan pH gradijent izmeu dviju elektroda. Gradijent se uspostavlja pomou smjese noseih amfolita (organske baze i kiseline) koji se rasporede u gelu prema njihovim izoelektri nim to kama kad se gel podvrgne djelovanju elektri ne struje (prefokusiranje). U fazi fokusiranja ispitivani proteini putuju prema anodi ili katodi, ovisno o njihovom naboju odnosno prema zoni koja ima pH vrijednost jednaku njihovoj izoelektri noj to ki. Kako su u toj to ki proteini elektri ki neutralni, oni gube elektroforetsku pokretljivost i fokusiraju se u uskoj zoni. Izoelektri no fokusiranje je prema tome ravnote~na tehnika u kojoj ne postoji u inak difuzije i stoga je izuzetno osjetljiva tehnika. Tehnika izoelektri nog fokusiranja koristi se u laboratorijskoj dijagnostici za razdvajanje raznih varijanti hemoglobina, odreivanje fenotipova -1antitripsina, razdvajanje oligoklonskih IgG i td. Izoelektri no fokusiranje izvodi se na gotovim, komercijalnim PAG plo ama razli itog pH raspona koji se posti~e dodatkom raznih amfolina. Gel pri vraen na GelBond film pomou par kapi vode prilijepi se na plo u s hlaenjem u kadi za elektroforezu. Mostie od debelog filtar papira uronjene u anodnu i katodnu otopinu postavi se na rubove gela i spoje elektrode. Nakon prefokusiranja, nanesu se uzorci u ~eljeno podru je pH. Po zavraetku izoelektri nog fokusiranja na gelu, fiksiranja razdvojenih proteina izvodi se bojenje bilo srebrom bilo bojom kao ato je Coomassie-Blue (slika 3.) Slika 3.: Izoelektri no fokusiranje seruma i likvora uz bojenje s Coomassie-Blue  >@\VZ\j ( !x%%&h'j''P++.T/V//j?l?@ 5CJH*CJ55CJ$ >@j f  ( 4 !\"#x% & F  & F  & F & F >@j f  ( 4 !\"#x%%%%%%%%%%&~&&h'j''+........T/V//03569:h?j?l?n?p?r?t?v?x?z?@    Dx%%%%%%%%%%&~&&h'j''+........T/V//0303569:h?j?l?n?p?r?t?v?x?z?@. A!"#$% [$@$NormalmH4@4 Heading 1$@&5CJ0@0 Heading 2$@&CJ<A@<Default Paragraph Font*B@* Body TextCJL    d@!x%03@"$%@#Centralni biokem. laboratorij1C:\Olympus\My Documents\ELEKTROFOREZA-prof st.docCentralni biokem. laboratorij>C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of ELEKTROFOREZA-prof st.asdCentralni biokem. laboratorij>C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of ELEKTROFOREZA-prof st.asdCentralni biokem. laboratorij>C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of ELEKTROFOREZA-prof st.asdCentralni biokem. laboratorij>C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of ELEKTROFOREZA-prof st.asdCentralni biokem. laboratorij>C:\WINDOWS\TEMP\AutoRecovery save of ELEKTROFOREZA-prof st.asdLaboratorij za proteine[C:\Documents and Settings\Administrator\My Documents\LABPROT\PROT\ELEKTROFOREZA-prof st.doc .[*wW8Z >wg@Z/HZwIZTwEVw8Zw d`w  hhOJQJo(n hhB*CJOJQJo(  hhOJQJo(n hhB*CJOJQJo( hhB*CJOJQJo( hhB*CJOJQJo(  hhOJQJo(n  hhOJQJo(n  hhOJQJo(n  hhOJQJo(n .[*T >EV d`8ZW8/Hg@wI @EEtAED{X ```$`&`,`4`6GzTimes New Roman5Symbol3& zArial;Wingdings"1hwrbIteY 4!0p ELEKTROFOREZACentralni biokem. laboratorijLaboratorij za proteineOh+'0 , H T ` lxELEKTROFOREZAoLEKCentralni biokem. laboratorijMientNormalnLaboratorij za proteine22oMicrosoft Word 8.0e@@@b,@3(Y՜.+,D՜.+,@ hp   KBC REBROR4 pj ELEKTROFOREZA Title 6> _PID_GUIDAN{8422DE1D-2131-11D6-8D5F-D7806C2B7B33}  !"#$%&()*+,-.012345689:;<=>ARoot Entry FC!P(C1Table'WordDocumentLSummaryInformation(/DocumentSummaryInformation87CompObjjObjectPool!P(!P(  FMicrosoft Word Document MSWordDocWord.Document.89q