hrvatski

Mehanizmi diskriminacije izoleucil-tRNA-sintetaze prema α-aminobutiratu i njegovim fluoriranim analozima

Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) je enzim koji katalizira aktivaciju i prijenos aminokiseline na tRNAIle (slika 1, crno). Pri tome nastaje Ile- tRNAIle koja je supstrat ribosomske sinteze proteina. IleRS aktivira i prenosi na tRNAIle i nepripadne aminokiseline valin i norvalin, što može uzrokovati pogrešku u sintezi proteina. Norvalin je neproteinogena aminokiselina koja se može akumulirati u stanici te je, kao i valin, jednu metilensku skupinu manji od izoleucina. Kako bi se pogreška u sintezi proteina spriječila, IleRS primjenjuje popravke pogreške prije i poslije prijenosa (slika 1, narančasto/crveno). Da bismo istražili kako smanjenje hidrofobnosti utječe na diskriminaciju aminokiselina, kinetički smo okarakterizirali α-aminobutirat (α-ABA) u reakcijama IleRS. α-ABA je, kao i norvalin, neproteinogena metabolička aminokiselina, a od izoleucina je manja dvije metilenske skupine. Eksperimenti su pokazali kako IleRS aktivira i prenosi α-ABA na tRNAIle s brzinama sličnim kao i izoleucin. Ipak, IleRS diskriminira α-ABA temeljno na razini Km čija je vrijednost 3500 puta veća nego Km izoleucina. Iako se α-ABA uspješno aktivira i prenosi na tRNAIle, nije opažena akumulacija α-ABA-tRNAIle zbog aktivnih popravaka pogreške IleRS. Zaključujemo kako smanjenje hidrofobnosti temeljno utječe na vezanje aminokiseline (Km efekt) dok je utjecaj na brzine reakcija kataliziranih s IleRS malen. Nadalje, kako bismo istražili hoće li povećanje hidrofobnosti uslijed fluoriranja utjecati na diskriminaciju α-ABA, istražili smo kinetiku di- i tri-γ-fluoriranih analoga α-ABA u reakcijama IleRS. Dodatak fluora temeljno utječe na smanjenje brzine aktivacije (do 5 puta), dok je efekt na vezanje supstrata i na reakcije popravka pogreške iznenađujuće malen. Dakle, u slučaju IleRS, fluoriranje α-ABA ne nadoknađuje gubitak hidrofobnih interakcija uzrokovan smanjenjem veličine supstrata. Nadalje, naši rezultati sugeriraju kako „polarna hidrofobnost“, specifično svojstvo fluora, ima negativan utjecaj na vezanje supstrata u aktivno mjesto IleRS. Nepredvidljivost interakcija fluora s enzimom može učiniti reinženjering aminoacil-tRNA-sintetaza, s ciljem efikasnijeg ugrađivanja fluoriranih aminokiselina u proteine, znatno zahtjevnijim nego što se očekivalo.

Izoleucil-tRNA-sintetaza, alfa-aminobutirat, fluorirane aminokiseline, hidrofobnost

nije evidentirano