hrvatski

Utjecaj uvjeta ekspresije alkalne fosfataze iz bakterije Escherichia coli na određivanje katalitičke konstante

Alkalna fosfataza (AP) je enzim koji katalizira hidrolizu fosfomonoesterske veze. AP izolirana iz bakterije Escherichia coli postiže maksimalnu aktivnost kada je u M1 i M2 metal- vezna mjesta vezan Zn2+, a u M3 Mg2+ [Wang, J., Stieglitz, K. A., Kantrowitz, E. R. (2005) Biochemistry, 44(23), 8378-8386]. Za ekspresiju AP korišteni su plazmidi pGP1–2 i pET11d. Mjerenjem aktivnosti AP izolirane iz E. coli_WT1 ustanovljena je izrazito niska aktivnost. Uspoređujući rezultate aktivnosti AP izolirane iz svježe transformiranih kultura s aktivnosti AP koja je određena u prethodnom diplomskom radu, a u kojem je korišten isti enzim i ekspresijski sustav, ustanovljeno je da je aktivnost transformiranih kultura E. coli_WT niska. Kromatogrami ukazuju da soj E. coli E15 eksprimira AP, no mjerenjem aktivnosti enzima ustanovljeno je da se radi o neaktivnoj AP. Pretpostavlja se da su kcat vrijednosti niže od očekivanih upravo zbog neaktivne AP, jer se niske vrijednosti kcat mogu objasniti velikom količinom neaktivnog proteina. Praćenjem aktivnosti u ovisnosti o vremenu primijećeno je da tijekom vremena dolazi do promjene aktivnosti AP. Pretpostavlja se da zbog promjene u zasićenosti metalima i/ili promjene konformacije AP tijekom vremena dolazi do promjene u aktivnosti. Rezultati aktivnosti AP, izolirane iz induciranih i neinduciranih kultura E. coli_WT1 kao i induciranih i neinduciranih novo transformiranih kultura E. coli_WT, navode na zaključak da je problem u sustavu za ekspresiju gena.

alkalna fosfataza, ekspresijski sustavi, konformacijske promjene, aktivnost enzima

nije evidentirano