hrvatski

Usmjerena mutageneza phoA gena

Alkalna fosfataza je nespecifična fosfohidrolaza koja katalizira hidrolizu i transfosforilaciju organskih fosfomonoestera. Optimalnu aktivnost postiže u alkalnom mediju. Alkalna fosfataza je alosterički enzim i pokazuje odstupanja od Michaelis-Menten kinetike. Naime, vezivanje liganada na jedno vezno mjesto izaziva promjenu konformacije proteina koja utječe na kinetička svojstva udaljenog veznog mjesta. Podjedinice ALP međusobno utječu jedna na drugu. U ovom je radu izvršena mutacija aminokiseline Thr-81 u Ala-81. Thr-81 se nalazi na dodirnoj površini podjedinica i vjerojatno je vodikovim vezama povezana s istom aminokiselinom susjedne podjedinice. Zamjenom Thr-81 u Ala-81 onemogućeno je stvaranje vodikovih veza, a komunikacija među podjedinicama je otežana, što zasigurno utječe na kinetička svojstva enzima. Kao DNA kalup korišten je ekspresijski vektor pET11d koji posjeduje ukloniran phoA gen. Od ponuđena dva selekcijska oligonukleotida odabran je selekcijski oligonukleotid koji se označava kao TOP STRAND jer se nalazi na istom lancu DNA kao i mutageni oligonukleotid. Za plazmid pET11d + phoA, koji je prethodno denaturiran, postavljena je mutacijska reakcija, a mutageni i selekcijski oligonukleotid su dalje sintetizirani i povezani T4 polimerazom i T4 ligazom. Mutiranim plazmidom transformirane su BMH 71-18 mutS kompetentne stanice koje ne posjeduju mehanizme popravka pogrešno sparenih nukleotida. Time se povećala mogućnost zadržavanja mutacija. Plazmid se u tim stanicama nalazio nekoliko generacija, a zatim je izoliran i njime su transformirane JM109 kompetentne stanice. Te stanice osiguravaju pravilnu segregaciju mutiranih plazmida i plazmida divljeg tipa. Osim te mutacije uvedeno je i novo restrikcijsko mjesto za enzim Nae I. Koristeći restrikcijski enzim Nae I izvršena je analiza transformanata. Od osam ispitanih kolonija u tri kolonije su pronađene mutacije. Nemutirani plazmid, podvrgnut restrikcijskoj analizi, daje 4 fragmenta veličine 5019, 1588, 354 i 160 parova baza, a mutirani plazmid 5 fragmenata veličine 4574, 1588, 445, 354 i 160 parova baza. Cilj rada je ostvaren, a to je uspješno uvođenje mutacije. Da li to utječe na kinetička svojstva enzima ostaje tek da se ispita.

nije evidentirano

nije evidentirano