hrvatski

Kloniranje gena za alkalnu fosfatazu

Alkalna fosfataza je enzim koji katalizira hidrolizu i transfosforilaciju organskih fosfomonestera, a maksimalnu aktivnost postiže u alkalnom područu. U bakteriji E. coli alkalna fosfataza je kodirana phoA genom koji je dio pho regulona. Transkripcija phoA se odvija na kromosomu. Konačna modifikacija se odvija na citoplazmatskoj membrani i u periplazmi gdje se i nakuplja, a male količine se ispuštaju i u medij. U ovom radu gen phoA je ukloniran u ekspresijski vektor pET11d. Ekspresijski vektor pET11d ima promotorsko mjesto za T7 RNA polimerazu koja je pod kontrolom lac operatora. Gen phoA ukloniran nizvodno od T7 promotora doveden je pod njegovu kontrolu. Transkripcija phoA pomoću T7 RNA polimeraze može početi tek kad se doda induktor IPTG koji blokira lac represor i na taj način oslobađa lac operator. Za izolaciju phoA gena iz pCR2.1 plazmida, u kojeg je prethodno ukloniran, postavljena je restrikcijska digestija s BamHI i NcoI. Insert s phoA genom i linearizirani vektor pET11d elektroforetski su razdvojeni iz restrikcijskih smjesa te iz gela pročišćeni uz pomoć DNA Extraction Kit-a i povezani uz pomoć T4 DNA ligaze. Ligacijskom reakcijom su prvo transformirane stanice soja E. coli DH5a, jer se pokazalo da se 20-30 puta bolje transformiraju od stanica soja E. coli BL21(DE3) koje su pravi domaćini za pET11d vektor. Stanice soja BL21(DE3) posjeduju T7 RNA polimerazu i u njima može doći do transkripcije phoA gena ukloniranog u pET11d plazmid. Indukcija transkripcije phoA gena s plazmidne DNA vršena je dodatkom različitih koncentracija IPTG-a u medij. Mjerenjem aktivnosti alkalne fosfataze u mediju zabilježena je veća aktivnost u BL21(DE3) stanicama transformiranih konstruktom u odnosu na stanice transformirane s pET11d. Za indukciju je najpovoljnija 1 mM koncentracija IPTG-a, ali razlika u odnosu na ostale koncentracije nije znanto velika. Ovim radom je pokazano da se ugradnjom phoA u pET11d i indukcijom s IPTG-om može postići jaka ekspresija alkalne fosfataze te da čak dolazi do pojačanog lučenja u medij. Budući da točna uloga alkalne fosfataze nije poznata neophodna su daljnja istraživanja da bi se riješilo ovo pitanje. Kloniranje je otvorilo novi pristup istraživanjima strukture i funkcije alkalne fosfataze omogućivši dobivanje gotovo neograničene količine enzima u strogo kontroliranim uvjetima.

nije evidentirano

nije evidentirano