hrvatski

Kinetička razdioba u sintetskom mjestu izoleucil- tRNA-sintetaze određuje mehanizam diskriminacije nepripadnih aminokiselina

Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) je enzim koji u dva koraka katalizira nastajanje Ile-tRNAIle koja je supstrat u ribosomskoj sintezi proteina. Prvo se aminokiselina aktivira i nastaje aminoacil- adenilat (1) dok drugi korak obuhvaća prijenos aminokiseline na tRNA (4). Prijetnju točnosti nastajanja Ile-tRNAIle (aminoacilacija) u stanici predstavljaju strukturno slične, nepripadne aminokiseline, poput valina, koje IleRS inicijalno diskriminira na razini vezanja u sintetsko mjesto. Kako ta diskriminacija nije dovoljno efikasna, IleRS upotrebljava i mehanizme popravka vlastite pogreške: tRNA-neovisni (2) i tRNA-ovisni (3) popravak pogreške prije prijenosa (hidroliza aminoacil-adenilata) te popravak pogreške poslije prijenosa aminokiseline (5) (hidroliza aminoacil- tRNA). U ovom radu kinetički je okarakterizirana sposobnost diskriminacije IleRS iz bakterije Escherichia coli prema neproteinogenoj aminokiselini (S)-2-aminobutirična kiselina (α- Aba). Unatoč tome što je jedna od najstarijih aminokiselina i što se akumulira u stanici, ona ne gradi proteine. Stoga je zanimljivo pitanje diskriminira li se α-Aba od strane IleRS poput nepripadnog, proteinogenog valina? U aktivaciji IleRS diskriminira α-Aba temeljno kroz povećanje Km, a manje kroz snižavanje kcat. Suprotno očekivanom, reakcija prijenosa α-Aba na tRNA je do 10 puta brža nego uz pripadni izoleucin i nepripadni valin. Iako preliminarni rezultati sugeriraju da je hidroliza α-ABA-tRNAIle spora, IleRS ne aminoacilira tRNAIle s α Aba. Aminoaciliranje je opaženo uz mutant IleRS koji ne posjeduje popravak pogreške poslije prijenosa, što sugerira kako je taj popravak, iako manje efikasan nego uz valin, presudan za točnost aminoacilacije u prisutnosti α-Aba. Detalje mehanizma još proučavamo. Konačno, IleRS ne elimira α Aba kroz tRNA-ovisan popravak pogreške prije prijenosa, koji je do sada smatran kao temeljna karakteristika IleRS. Zaključujemo kako se α-Aba drugačije diskriminira od valina, što se očituje kroz brzi prijenos koji kinetički kompetira hidrolizi aminoacil-adenilata te sporiji popravak pogreške poslije prijenosa. Dodatno se proučavaju fluorirani analozi α-Aba, zanimljivi zbog uloge novih gradivnih blokova protein. Značajna razlika u mehanizmu diskriminacije α-Aba i fluoriranih analoga od strane IleRS nije uočena.

Izoleucil-tRNA-sintetaza, alfa-aminobutirat, fluorirane aminokiseline, popravak pogreške

nije evidentirano