hrvatski

Nekovalentne interakcije aminoacil-tRNA-sintetaza : utjecaj tRNA na afinitet enzima prema ostalim supstratima

Aminoacil-tRNA-sintetaze (aaRS) kataliziraju nastajanje kovalentne veze između pripadnog para aminokiseline i transfer RNA. Nekovalentni kompleksi sintetaza iz kvasca Saccharomyces cerevisiae i to ; seril-tRNA-sintetaze (SerRS) i tRNASer, odnosno tirozil-tRNA-sintetaze (TyrRS) i tRNATyr detektirani su MALDI spektrometrijom masa. Iz eksperimentalno određenih molekulskih masa zaključeno je da obje sintetaze (a2) stvaraju komplekse tipa (a2)· tRNA i (a2)· tRNA2 s molekulama pripadne tRNA. Specifičnost nastalih kompleksa, obzirom na mogućnost nastanka nespecifičnih agregata iz plinske faze, potvrđena je kompeticijskim eksperimentom na serinskom i tirozinskom sustavu. Stabilnost nekovalentnih kompleksa SerRS· tRNASer studirana je i retardacijskom gel-elektroforezom. Utjecaj nekovalentnih interakcija SerRS i tRNASer na afinitet SerRS prema serinu i ATP-u, istražen je kinetičkim mjerenjima aktivacije serina sa i bez analoga tRNASer. Korišteni analozi, oksidirana tRNASer i tRNASer skraćena za jedan nukleotid na 3’ -kraju, stvarali su stabilne nekovalentne komplekse sa SerRS, a u reakciji aminoaciliranja nisu mogli vezati serin. Budući da u prisutnosti analoga tRNASer dolazi do smanjenja vrijednosti KM za serin, zaključeno je da prilikom interakcije SerRS i tRNASer dolazi do konformacijske promjene u aktivnom mjestu enzima, koja za posljedicu ima poboljšanje veznog mjesta za serin. Analozi tRNASer nisu utjecali na vrijednost KM za ATP. Nekovalentni kompleks SerRS· tRNASer manje griješi od nekompleksiranog SerRS pri izboru pripadne aminokiseline, što je dokazano reakcijom izmjene pirofosfata u kojoj je serin zamijenjen treoninom. Pokusi prikazani u ovom radu pokazuju da nekovalentne interakcije između SerRS i tRNASer, direktno utječu ne samo na točnost prilikom izbora pripadne tRNA, nego i na točnost cjelokupne reakcije aminoaciliranja

izmjena pirofosfata; MALDI-MS; nekovalentni kompleksi; SerRS; TyrRS; tRNA; tRNA-ovisan afinitet prema serinu

nije evidentirano