hrvatski

Biofilm-značaj i metode detekcije

Formiranje biofilma je genetski reguliran proces u životu bakterija i odvija se kroz nekoliko faza pri čemu je prisutna intercelularna komunikacija. U biofilmu bakterije pokazuju drugačije osobine u odnosu na svoje planktonske stanice, prije svega zbog drugačijeg profila transkripcije gena. Bakterijske stanice unutar biofilma nalaze se u EPS-u koji im pruža zaštitu od obrambenih mehanizama domaćina kao i od antimikrobnih sredstava. Poslednjih godina prisutan je porast infekcija izazvanih bakterijama koje stvaraju biofilm, a čija je odlika kronični tijek i recidivirajući karakter. Biofilm infekcije, kao što su upala pluća u pacijenata s cističnom fibrozom, kronične rane, kronični otitisni mediji i infekcije povezane s implantatima i kateterima, predstavljaju sve veći problem u svijetu. Važna obilježja kroničnih infekcija temeljenih na biofilmu su ekstremna otpornost na antibiotike i mnoge druge konvencionalne antimikrobne lijekove, te ekstremni kapacitet za izbjegavanje obrane domaćina. Kod oportunističkih patogena, poput Staphylococcus epidemidis, sposobnost formiranja biofilma smatra se čimbenikom virulencije jer do tada komenzalne bakterije postaju ozbiljan izvor bolničkih infekcije.Metode za detekciju biofilma su: Pelikula test Kategorizacija bakterijskih sojeva odnosno njihove sposobnosti da produciraju biofilm, izvodi se na temelju produkcije pelikule na površini tekuće faze LB bujona u koji je inokulirana suspenzija bakterijskog soja gustoće o, 5 MF i nakon inkubacije od 96 h na temperaturama od 25°C i 37°C. Na temelju debljine pelikule, procjenjuje se da li je bakterijski soj jak, umjeren ili slab produktor biofilma. Odsustvo pelikule govori da se radi o odsustvu sposobnosti produkcije biofilma. Kristal violet test u mikrotitar pločicama U jažice mikrotitar pločice u kojima je LB bujon, dodaje se suspenzija ispitivanog bakterijskog soja (0, 5MF). Negativna kontrola -samo LB bujon. Pločice se inkubiraju tijekom 48h na temperaturi od 25°C . Nakon završenog inkubiranja neadherirane stanice se uklanjaju ispiranjem (3 x)sterilnom vodom. Preostale adherirane bakterijske stanice se fiksiraju sušenjem na sobnoj temperaturi, nakon čega se dodaje 0, 5% kristal violet, inkubira se 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nevezana boja se uklanja ispiranjem sterilnom vodom. Mikrotitar pločice se suše. Kristal violet koji je ostao vezan za adherirane bakterije otapa se dodavanjem dekolorizatora. Pločice se ostavlja na sobnoj temperaturi 15 minuta. Očitava se spektrofotometrom, filter valne duljine od 595 nm.Vrijednosti apsorbancije za karakterizaciju biofilm produkcije testiranih bakterijskih sojeva dobiju se umanjenjem svake dobivene apsorbancije za vrijednost apsorbancije negativne kontrole.Temeljem dobivenih vrijednosti apsorbancije, izolati su klasificirani u četiri kategorije: jak, umjeren, slab ili ne produktor biofilma. Ispitivanje utjecaja antibiotika na formirani biofilm u mikrotitar pločicama U jažice mikrotitar pločice u kojima je LB bujon, dodaje se suspenzija ispitivanog bakterijskog soja (0, 5MF). Negativna kontrola -samo LB bujon. Pločice se inkubiraju tijekom 48h na temperaturi od 25°C . Nakon završenog inkubiranja neadherirane stanice se uklanjaju ispiranjem (3 x)sterilnom vodom.U svaku jažicu staviti fosfatni pufer i antibiotik kako bi konačna koncentracija antibiotika u svakoj jažici odgovarala 0, 5MIC, 1MIC, 2MIC i 4MIC. Nakon dodavanja antibiotika pločice se inkubiraju 15, 30 i 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubiranja utjecaj antibiotika na količinu formiranog biofilma se određuje kvantifikacijom biofilma primjenom kristal violet testa. Utjecaj antibiotika na inicijalnu adheziju i formirani biofilm ocjenjuje se na temelju postotka redukcije apsorbancije u odnosu na netretirane uzorke.

Biofilm, metode detekcije

nije evidentirano