hrvatski

Transformacija kvasca ilegitimnom integracijom jednolančane linearne DNA

Uspješna transformacija kvasca Saccharomyces cerevisiae dvolančanim nereplikativnim plazmidima koji sadrže kvašćeve fragmente DNA najčešće je uzrokovana procesima homologne rekombinacije (HR) koji mogu dovesti do integracije plazmidne DNA u kromosome kvasca ili konverzije kromosomskih mutacija. Integracija plazmidne DNA može se dodatno stimulirati i do 1000 puta uvođenjem dvolančanih lomova unutar kvašćevih fragmenata prisutnih na plazmidu, što najčešće dovodi do ciljane integracije plazmidne DNA u homologni kromosomski lokus. U ovom radu pokazano je da se isti plazmidi mogu integrirati u kvašćevu genomsku DNA djelomično i procesom ilegitimne rekombinacije (IR), no s vrlo niskom učestalošću dajući svega 0, 5% nekonzervativnih integracija plazmida. Nasuprot dvolančanim plazmidima, jednolančana plazmidna DNA s regijama homolognim kvašćevom genomu pokazala se daleko boljim supstratom za ilegitimnu integraciju. Cijepanje jednolančanog plazmida u homologiji ne povećava frekvenciju transformacije i ne dovodi do ciljane, nego naprotiv, do ilegitimne integracije. Ipak, većina integracijskih događaja događa se u samoj blizini homolognih kromosomskih lokusa. Kružna i linearizirana jednolančana DNA znatno se razlikuju u sposobnosti da konvertiraju velike insercije (6, 1 kb), ali ne i točkaste mutacije prisutne u kromosomskoj DNA. U nedostatku homologije između plazmidne i kromosomske DNA linearni i kružni jednolančani plazmidi transformiraju stanice kvasca s 100 puta većom uspješnošću u odnosu na dvolančani oblik plazmida. Ilegitimna integracija jednolančane plazmidne DNA dovodi do niza složenih promjena u genomu kvasca: višestrukih tandemskih integracija, kromosomskih prerasporeda i nastanka ekstrakromosomskih replikativnih elemenata koji sadrže mitohondrijsku DNA. Diploidni transformanti dobiveni ilegitimnom integracijom jednolančane DNA pokazuju smanjenu efikasnost sporulacije, a neki od njih i smanjenu vijabilnost spora. Međutim, neke od nastalih genetičkih promjena u genomskoj DNA diploidnih stanica kvasca mogu se prenijeti i na haploidno potomstvo. Na temelju svih ovih opažanja predloženo je da bi endogena i egzogena jednolančana DNA mogle imati značajnu ulogu u evoluciji kvašćeva genoma.

ilegitimna rekombinacija; jednolančana DNA; kromosomski prerasporedi; kvasac; nereplikativni plazmidi

nije evidentirano