hrvatski

Značaj biobanke tkiva i stanica pacijenata s rijetkim nasljednim metaboličkim bolestima u Hrvatskoj

Biološki uzorci i baza podataka u biobanci tkiva i stanica su jako bitni za razumijevanje i liječenje svih rijetkih bolesti uključujući i nasljedne metaboličke bolesti čiji pacijenti umiru u ranim godinama života. Biološke materijale poput urina, pune krvi, plazme, leukocita, DNA, stanične kulture kožnih fibroblasta, skeletnih mioblasta te bioptate jetre i mišića, trebalo bi skladištiti u biobanku s ciljem dijagnostike, terapije i istraživanja. Uskladišteni biološki materijal pacijenata s rijetkim metaboličkim bolestima omogućava istraživanja i bolje razumijevanje genetske podloge bolesti. Mnogi pacijenti s rijetkim bolestima imaju zajedničke simptome, ali za prepoznavanje vrste bolesti i pravovremenu terapiju neophodna je suradnja vrhunskih stručnjaka, od liječnika na odjelu do genetičara, biokemičara i molekularnih biologa u laboratoriju. Stanične kulture fibroblasta i mioblasta daju mogućnosti proučavanja in vitro brojnih svojstava stanica vezivnog tkiva i mišićnih stanica što je izrazito važno za razjašnjavanje brojnih prirođenih i stečenih bolesti, za razumijevanje fizioloških zbivanja u organizmu kao i preduvjet za proučavanje brojnih lijekova. Na razini EU uočene su velike razlike u provedbi važećih direktiva, što predstavlja dodatni problem u iskoristivosti uzoraka pohranjenih u biobankama te posljedično umanjuje javnu zdravstvenu korist tih zbirki. Biološki uzorci pacijenata kod kojih postoji sumnja na nasljednu metaboličku bolest prikupljeni su u skladu s hrvatskim i europskim zakonima. Komadić ljudske kože dostavlja se u mediju DMEM (engl. Dulbecco's modification of Eagle's medium) s dodatkom 20 % FBS (engl. Fetal bovine serum), 1% L-glutamina i 1% antibiotika (penicilin i streptomicin). Biopsija se usitni skalpelom na manje komadiće bez predhodnog odvajanja epidermisa od dermisa u kabinetu za sterilan rad. Medij treba mijenjati svaka 72 sata. Kada je primarna kultura dostigla konfluenciju oko 70%, stanice se tripsiniziraju (tripsin 0, 25 % i EDTA 0, 02 %), centrifugiraju (1100 rpm kroz 5 minuta) te se jedan dio zaledi, a drugi dio zasijava u nove subkulture. Uzorak skeletnog mišića prenosi se u prethodno pripremljene sterilne epruvete s proliferacijskim medijem. Osnovni medij je komercijalni medij Skeletal Muscle Cell Growht Medium tvrtke Promocell s dodatkom 5% faktora rasta. Dodatak čine epidermalni faktor rasta, faktor rasta fibroblasta i inzulin. U medij se dodaje 10% FBS, 1, 5% glutamina i antibiotika (penicilin i streptomicin). Svi postupci stanične kultivacije izvode se u sterilnim uvjetima s laminarnim protokom zraka. Tkivne matične stanice izoliraju se enzimskom digestijom u mediju koji sadrži tripsin iz bioptata skeletnog mišića bolesnika s nasljednom metaboličkom miopatijom. Ovako dobiveni mioblasti, uz manji dio fibroblasta, zasijavaju se u kultivacijske bočice u proliferacijskom mediju i pohranjuju u inkubator na +37 ˚C s 5% CO2. Za pročišćavanje mioblasta od fibroblasta koristi se magnetski MiniMACS-separator (engl. Magnetic-activated cell sorting). Mioblasti se obilježavaju specifičnim monoklonskim protutijelom (NCAM/CD56, Invitrogen) i IgG-mikrokuglicama, a zatim se čistoća provjerava na protočnom citometru. Pročišćeni mioblasti mogu se zamrznuti i dugotrajno čuvati u tekućem dušiku. Stanična kultura kožnih fibroblasta je optimalan a u većini slučajeva i neophodan biološki materijal za provođenje testova potvrde lizosomskih bolesti nakupljanja. Od iznimne je važnosti uspostava kulture mioblasta kao modela za daljnje istraživanje patogeneze miopatija i matičnih stanica. Nakon što su uspostavljene primarne i sekundarne kulture mioblasta te nakon što su mioblasti pročišćeni magnetskim separatorom, diferencirani su u miotube. Kontrola pročišćenosti mioblasta i vijabilnost stanica provjerene su metodom protočne citometrije i iznosila je 90%.Optimizirana je metoda prikupljanja, uzgoja, skladištenja i raspodjele humanih fibroblasta, skeletnih mioblasta koji u Hrvatskoj otvaraju nove mogućnosti dijagnostike i istraživanja na tkivnim matičnim stanicama s krajnjim ciljem stvaranja preduvjeta za osnivanje biobanke tkiva i stanica za rijetke bolesti kao i usklađivanje biobanke s europskom biobankom.

Biobanka; mioblasti; fibroblasti

nije evidentirano