hrvatski

Učinak oksidativnog stresa uzrokovanog 4-hidroksinonenalom na proliferaciju i diferencijaciju stanica in vitro

Proučavanje djelovanja reaktivnih kisikovih spojeva (ROS) i produkata lipidne peroksidacije na organizam vrlo često je obuhvaćalo njihovo toksično djelovanje, te štetne učinke koje imaju u razvoju mnogih patoloških procesa. Prvi podaci u kojima se spominju toksični učinci krajnjih produkata lipidne peroksidacije na stanice i tkiva pojavili su se u kasnim sedamdesetim godinama. 4-Hidroksi-2,3-nonenal (HNE), biološki aktivan aldehid i krajnji produkt lipidne peroksidacije je pronađen u mnogim eksperimentalnim i kliničkim stanjima u kojima dolazi do pojave oksidativnog stresa. Međutim, HNE i slični 4-hidroksi-2,3-alkenali različite dužine lanca ne djeluju samo kao toksični i mutageni medijatori ozljede uzrokovane oksidativnim stresom, nego i kao biološki signali u normalnim i patološkim stanjima. Danas se smatra da HNE i srodni aldehidi mogu djelovati kao signalne molekule koje mogu modulirati biološke događaje kao što su kemotaksija, prijenos signala, ekspresija gena, proliferacija i diferencijacija stanica. Cilj istraživanja bio je utvrditi učinak 4-hidroksi-2,3-nonenala na proliferaciju i diferencijaciju stanica mezenhimalnog porijekla in vitro. U tu svrhu smo ispitali stabilnost HNEa u eksperimentalnim uvjetima kakvi se koriste za rad sa staničnim kulturama; u prisustvu medija za uzgoj staničnih kultura i proteina. Stabilnost HNEa u vodenom mediju pri pH 7 je velika, dok se u DMEM mediju za uzgoj staničnih kultura raspada na 50% koncentracije tijekom 120 minuta. Međutim, tijekom 30 minuta u DMEM mediju njegova se koncentracija smanjuje samo za 15%. HNE se veže na albumin, ali to vezanje ne uzrokuje gubitak funkcionalnih skupina koje apsorbiraju u UV području. Za određivanje prisustva HNEa vezanih za proteine stanica u obliku HNE-histidinskih konjugata u staničnim kulturama koristili smo HOS i WI38 stanice, kao i normalne ljudske osteoblaste koji su bili izloženi djelovanju HNEa različitih koncentracija. Imunocitokemijsko određivanje HNE-histidinskih konjugata u staničnim kulturama pokazalo je da se lako moglo odrediti prisustvo HNEa ukoliko su stanice bile tretirane 100 μM HNEom, te 10 μM HNEom iako slabije, dok se vezanje 1 μM HNEa na stanice nije moglo utvrditi ovom metodom. Intenzitet obojenja bio je sličan u svim promatranim staničnim linijama, a učinak na morfologiju stanica nije bio značajan. Koristeći metode elektronske mikroskopije, utvrđeno je da ukoliko su HOS stanice proučavane u uvjetima bez seruma odmah nakon odvajanja od podloge, dodatak već 10 mM koncentracije HNEa uzrokovao je gubitak staničnih izdanaka, zaokruživanje, a kod 100 mM koncentracije na staničnoj su se membrani pojavili mjehurići. Izrazita oštećenja mitohondrija u HOS stanicama primjetili smo ukoliko su stanice bile izložene djelovanju 100 μM HNEa: mitohondriji su bili nabubreni, s oštećenim i razorenim kristama, a u njihovoj su unutrašnjosti bile primjećene kružne tvorevine. Stanične kulture HOS i WI38 stanica i normalnih ljudskih osteoblasta tretirane 100 μM HNEom su lizirane kako bi se odredio proteinski sastav i raspodjela vezanja HNEa za pojedine proteinske frakcije Rezultati su pokazali da nije postojala razlika u sadržaju i količini proteina u kontrolnim staničnim kulturama i staničnim kulturama koje su tretirane s HNEom, kao ni razlika u vezanju HNEa za pojedine proteinske frakcije: HNE se jednolično vezao za sve proteinske frakcije u lizatima staničnih kultura. U supernatantima staničnih kultura pronađen je različit sastav HNE-proteinskih konjugata koji je vjerojatno odraz otpuštanja različitih proteina iz različitih vrsta stanica. Prema dobivenim rezultatima, činilo se da su se normalni ljudski osteoblasti razlikovali od HOS i WI38 stanica po tome što u supernatantu kultura nisu imali proteine mol. mase oko 68, a imali su više proteina 48 kDa. Učinak HNEa različitih koncentracija na proliferaciju HOS stanica u kulturi odredili smo mjerenjem ugradnje radioaktivnog timidina. Visoka, 100 mM koncentracija HNEa uzrokovala je snažnu inhibiciju proliferacije stanica, koju nije bilo moguće poništiti povećanjem koncentracije seruma, dok je 10 mM HNE uzrokovao inhibiciju rasta koja je djelomično poništena povećanjem koncentracije seruma. Pokusi u kojima smo pratili učinak HNEa na broj HOS stanica u kulturi pokazali su da je inhibicija rasta stanica uzrokovana 10 mM HNEom uslijedila zbog citostatskog učinka HNEa, budući da je u supernatantu kultura pronađen vrlo mali udio mrtvih stanica (manje od 6%). Koncentracija HNEa od 100 mM smanjila je unutarstaničnu koncentraciju glutationa u HOS stanicama (5 mM/106 stanica) za 64%, dok 10 mM HNEe nije utjecao na koncentraciju glutationa u stanicama u promatranom vremenu od 3 sata. Nedostatak razlike u koncentraciji glutationa između HOS stanica izloženih djelovanju 10 mM HNEa i kontrolnih stanica ukazao je da ove stanice nisu oštećene u toj mjeri da bi došlo do njihove smrti, te da je vrlo mala koncentracija HNEa zapravo ušla u stanicu i nije imala značajan učinak na unutarstaničnu koncentraciju glutationa. Budući da je HNE utjecao na izgled stanica i nestanak citoplazmatskih izdanaka, ispitali smo sposobnost adherencije HOS stanica za podlogu u prisustvu različitih koncentracija HNEa. HNE je uzrokovao o koncentraciji ovisan porast ukupnog broja stanica u mediju kultura. Tako je pri najvećoj, 10 μM koncentraciji HNEa i porast broja stanica u mediju kultura bio najveći. Kako je HNE imao učinak na adherenciju HOS stanica za podlogu i njihov oblik, ispitan je njegov učinak na proliferaciju stanica u kulturi ovisno o postojanju međustaničnog kontakta. Stoga su u pokusima korištene stanice različite gustoće. Nije bilo značajnih razlika u proliferaciji ovih stanica u prisustvu različitih koncentracija HNEa. Uloga HNEa u procesima diferencijacije HOS stanica također je proučavana. Višekratno izlaganje HOS stanica u kulturi djelovanju 10 ľM HNEa pokazalo je da HNE smanjuje diferencijaciju osteosarkomskih HOS stanica u kulturi praćenu brojem ALP-pozitivnih kolonijai. Učinak HNEa na HOS stanice različitog stupnja diferencijacije također je ispitan. Pripremljene su dviju kulture HOS stanice koje su se međusobno razlikovale po stupnju diferencijacije i mitotičkom indeksu. Diferencirane stanice su se pokazale su osjetljivije na inhibiciju proliferacije uzrokovanu 10 mM HNEom. L-askorbinska kiselina sama nije imala učinka na rast HOS stanica u kulturi, ali je zajedno s 10 mM HNEom dovela do snažnije inhibicije rasta stanica nego što je to učinio sam HNE. Sličan učinak zamijećen je i na diferencijaciju HOS stanica u kulturi. L-askorbinska kiselina je zajedno s 10 mM HNEom smanjila broj ALP-pozitivnih, diferenciranih kolonija u kulturi u odnosu na broj diferenciranih kolonija u prisustvu samog 10 mM HNEa. HNE je uzrokovao i pojavu apoptoze u svim ispitivanim stanicama: ljudskim fibroblastima WI38, stanicama ljudskog osteosarkoma HOS te normalnim ljudskim osteoblastima. Intenzitet apoptoze te osjetljivost stanica razlikovala se ovisno o ispitivanim stanicama. HOS stanice su se pokazale najosjetljivije na proapoptotički učinak HNEa; 10 ľM koncentracija HNEa poticala je pojavu apoptoze koja je ostala prisutna tijekom 24 i 48 sati. Za razliku od njih, normalni ljudski osteoblasti i fibroblasti su se činili neosjetljivi na proapoptotičko djelovanje iste koncentracije HNEa. Visoka, 100 ľM koncentracija HNEa uzrokovala je pojavu apoptoze u svim ispitivanim vrstama stanica. Najmanje osjetljive na učinak HNEa pokazali su se normalni ljudski osteoblasti, čiji se broj u kulturi počeo oporavljati 48 sati nakon tretmana sa 100 μM HNEom, dok su najosjetljivije bile HOS stanice, u kojima je intenzitet apoptoze dodatno porastao nakon 48 sati. U pokusima u kojima je proučavana interakcija HNEa s čimbenicima rasta proučavana su tri osnovna modela reakcije: interakcija HNEa s čimbenicima rasta te njihov zajednički učinak na rast stanica u kulturi; učinak čimbenika rasta nakon kojeg dolazi HNE; učinak HNEa nakon kojeg slijedi čimbenik rasta. Na stanicama je testiran učinak slijedećih čimbenika rasta: inzulinu nalik čimbenika rasta 1 (IGF-1), alkalnog čimbenik rasta fibroblasta (bFGF), epidermalnog čimbenik rasta (EGF), čimbenika rasta porijeklom iz trombocita (PDGF) i transformirajućeg čimbenik rasta β (TGFβ). Važan podatak u ovako pripremljenim stanicama kako bi odgovarale na čimbenike rasta je nalaz da je 1 μM HNE značajno stimuliro rast stanica, što može značiti da u određenim uvjetima HNE može djelovati kao čimbenik rasta. Preinkubacija HNEa i čimbenika rasta tijekom 30 minuta prije dodatka u kulture stanica promijenila je njihov učinak. Svi čimbenici rasta smanjili su inhibicijski učinak 10 μM HNEa. Dodatak čimbenika rasta prije ili poslije HNEa poremetio je učinke čimbenika rasta na proliferaciju stanica. Inhibicijski učinak 10 μM HNEa na proliferaciju stanica djelomično je poništio samo IGF-1. Zato je ispitan učinak HNEa na pojavu IGF-1 proteina u staničnim kulturama HOS, WI38 stanicama i normalnih ljudskih osteoblastia. Tako je HNE u kulturama HOS stanica smanjio količinu IGF-1 proteina, dok je povećao u kulturama WI38 stanica (10 μM HNE) i djelovao dvojako u kulturama osteoblasta: povećao sintezu pri 1 mM, a smanjio u prisustvu 10 μM HNEa. Učinak HNEa na ekspresiju proteina koji imaju važnu ulogu u staničnom ciklusu također je ispitan na kulturama HOS, WI38 stanica i normalnih ljudskih osteoblasta. Ove stanice sadržavale su malu kolčinu c-Fos proteina u kontrolnim kulturama koja se uvećala 1 sat nakon što su stanice bile izložene djelovanju HNEa. Sve stanice reagirale su jednako, a najveći porast zapažen je u prisustvu 10 μM HNEa. Isto tako, ispitan je učinak HNEa na ekspresiju c-Myc proteina u staničnim kulturama. Kontrolne stanične kulture sadržavale su malu količinu c-Myc proteina u jezgrama stanica koja se još više smanjila dodatkom HNEa. Pri tom je najveće smanjenje bilo u prisustvu najveće, 10 μM koncentracije HNEa. Dobiveni rezultati na staničnim kulturama ukazuju na kompleksnu ulogu HNEa u procesima proliferacije i diferencijacije stanica i upućuju na vjerojatnu uključenost HNEa u mnoge fiziološke procese u organizmu. Daljnja istraživanja svakako su neophodna kako bi se pojasnila uloga HNEa u ovim procesima.

4-hidrosinonenal; oksidativni stres; proliferacija; diferencijacija

nije evidentirano