hrvatski

Primjena lančane reakcije polimeraze u višestrukoj genetskoj analizi na razini jedne tumorske stanice

Molekularna analiza tumora zahtijeva precizno definiranu, homogenu populaciju tumorskih stanica. Nakon optimiziranja reakcije PCR i predumnažanja genoma (PEP) na razini pojedinačnih stanica, predumnožili smo metodom PEP mikrodisekcije deparafiniziranog tumorskog tkiva nakon izolacije DNA. U analizi nismo odabirali pojedinačne tumorske stanice, već nakupine homogenih stanica, kako bismo bili sigurni da neće doći do preferencijalnog umnažanja samo jednog alela u reakciji PCR, fragmentiranosti DNA ili gubitka dijela jezgre za vrijeme pripreme preparata. Određivanjem slijeda nukleotida u tri produkta reakcije PCR na predumnoženoj DNA ustanovili smo da reakcija PEP ne unosi pogreške u predumnoženu DNA. Usporedbom rezultata dobivenih na mikrodisekcijama deparafiniziranog tumorskog tkiva iz kojih je DNA izolirana klasičnim načinom te predumnažanjem ustanovili smo da je metoda pogodna za analizu mikrodisekcija deparafiniziranog tumorskog tkiva. Metoda PEP omogućuje u nekim slučajevima, zbog manje količine inhibitora u manjim rezovima tkiva, umnažanje odsječaka DNA u reakciji PCR koji se ne mogu umnožiti na razini klasično izolirane DNA iz deparafiniziranih rezova tkiva. Obzirom da se kod uzimanja mikrodisekcija uzima puno manji broj homogenih stanica, metoda PEP pogodna je u analizama LOH, budući da je postotak normalnih stanica puno manji nego u klasičnim izolacijama DNA. Analizom polimorfnih biljega pokazali smo da je metoda PEP pogodna za analizu ponavljajućih slijedova nukleotida. Metodama PCR, RFLP, SSCP i određivanjem slijeda nukleotida uspješno smo analizirali promjene u genima APC, MCC ; p53, K-ras, nm23-H1 i MSH2 u mikrodisekcijama deparafiniziranog tkiva osoba s FAP-om, HNPCC-om i sporadičnim karcinomima debelog crijeva.

lančana reakcija polimeraze (PCR); predumnažanje genoma (PEP); karcinom debelog crijeva

nije evidentirano