hrvatski

Strukturna istraživanja proteinskog kompleksa atipične seril-tRNA-sintetaze

Glavno područje našeg znanstvenom rada i interesa su makromolekulska udruživanja tijekom biosinteze proteina u smislu identifikacije novih proteinskih partnera, mehanizma njihovog međusobnog prepoznavanja te kvalitativne i kvantitativne analize interakcija uz pomoć fluorescencijske spektroskopije, površinske rezonancije plazmona, termoforeze i kristalografije. Budući da je kristalna struktura arhejske seril-tRNA-sintetaze (SerRS) već određena [1], pristupili smo kristalizaciji kompleksa SerRS i arginil-tRNA- sintetaze (ArgRS) jer je pokazano da upravo ova dva proteina tvore kompleks [2]. Kristalizacija ovakvog složenog sustava je vrlo zahtjevna jer su proteini velike molekule osjetljive na temperaturu, pH, ionsku jakost, prisutnost malih molekula i dr. Kako bismo dobili informacije o strukturi kompleksa, proteini su zasebno rekombinantno eksprimirani u bakteriji Escherichia coli i pročišćeni afinitetnom kromatografijom pomoću privjeska (His)6 na Zavodu za biokemiju, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb. Za potrebe rendgenske strukturne analize, proteini trebaju biti zadovoljavajuće čistoće, stoga su, prilikom pročišćavanja proteina, primijenjene metode ionsko-izmjenjivačke kromatografije, a upotrebom gel-filtracijske kromatografije dobiven je homogen uzorak koji je ukoncentriran ultrafiltracijom. Cilj istraživanja je dobiti veće kristale pravilnog oblika. Svaki proteinski sustav je jedinstven i nije moguće slijediti općenite smjernice za uspješnu kristalizaciju. Zbog toga je najprije potrebno sistematsko traženje najpovoljnijih fizikalno- kemijskih uvjeta za tvorbu kristala. Kristalizacija proteina strujanjem para je jedna od najčešće korištenih metoda za pripremu kristala proteina. Kapljica proteina se pomiješa s otopinom za kristalizaciju i stavi nad tu istu otopinu u zatvoreni bunarčić. Otopina za kristalizaciju se sastoji od precipitanta (tvar koja smanjuje topljivost proteina), soli i pufera. Korištene su metode sjedeće i viseće kapi. Proteini SerRS (dimer, Mr = 120000 ) i ArgRS (monomer, Mr = 60000) su pomiješani neposredno prije postavljanja kristalizacije u koncentraciji γ = 27 mg cm-3 te su, uz upotrebu robota za kristalizaciju The Gryphon LCP (Art Robbins Instruments), postavljene viseće kapi miješanjem 200 nl kompleksa i 200 nl kristalizacijske otopine pri 20 °C u laboratoriju profesora Nenada Bana (Institute of Molecular Biology and Biophysics, Eidgenössische Technische Hochschule (ETH) Zürich). Kompleksi su podvrgnuti procesu kristalizacije u ukupno 960 različitih višekomponentnih otopina za kristalizaciju. Otopine se razlikuju u vrsti i koncentraciji anorganskih soli, linearnih polimera i pH vrijednosti. Pojava prvih kristala primijećena je nakon 5 dana u kristalizacijskoj otopini koja je sadržavala 20% (w/v) polietilen-glikol (PEG, Mr = 3350) ili PEG monometil-etera (Mr = 500), kalijev izotiocijanat (c = 0, 3 - 0, 4 mol dm-3), 1, 3-bis- (tris(hidroksimetil)methilamino)-propan (c = 0, 1 mol dm-3), pH 8, 8. Određivanje trodimenzijske strukture proteina metodom difrakcije rendgenskih zraka zahtijeva pripremu jediničnog kristala proteina zadovoljavajuće veličine i kvalitete, pa nakon nalaženja početnih uvjeta kristalizacije uslijedila je optimizacija kako bi se dobili što veći i kvalitetniji kristali. Optimizacija kristalizacijskih uvjeta je uključivala variranje koncentracije proteina, precipitanta, soli, pH pufera u otopini za kristalizaciju, te temperature i veličine kapi. Pokazano je da dodatak stroncijeva klorida (c = 0, 1 mol dm-3) bitno utječe na kvalitetu kristala. [1] S. Bilokapic, T. Maier, D. Ahel, I. Gruic- Sovulj, D. Söll, I. Weygand-Durasevic, N. Ban. EMBO Journal (2006) 25:2498-2509. [2] V. Godinic-Mikulcic, J. Jaric, C.D.Hausmann, M. Ibba, I. Weygand-Durasevic. Journal of Biological Chemistry (2011) 286:3396-3404.

aminoacil-tRNA-sintetaze; proteinski kompleks; kristalografija

nije evidentirano