hrvatski

Metoda višestrukog umnažanja vezanih sondi u dijagnostici kongenitalne adrenalne hiperplazije uzrokovane deficitom 21-hidroksilaze

Nedostatak 21-hidroksilaze (21-OHD) najčešći je uzrok kongenitalne adrenalne hiperplazije (KAH), autosmno recesivnog poremećaja. obilježenog poremećenom sintezom kortizola iz kolesterola u adrenalnom korteksu. Razlikujemo dva osnovna oblika bolesti, teži ili klasični i blaži ili neklasnični oblik. Klasični oblik se dalje dijeli na jednostavni virilizirajući oblik (engl. simple virilizing, SV) i oblik s gubitkom soli (engl. salt-wasting, SW). Incidencija klasičnog oblika 21-OHD KAH-a procjenjuje se na 1:15 000 živorođenih. Dijagnoza 21-OHD KAH-a postavlja se na temelju kliničke slike i rezultata biokemijskih pretraga, a potvrđuje molekularno-genetičkim ispitivanjima. Molekularno genetičko testiranje gena CYP21A2 koji kodira 21-OHD, a koji uglavnom uključuje devet čestih mutacija i velike delecije, otkriva oko 80%-98% patogenih alela. Analiza sekvence cijele kodirajuće regije i susjednog promotorskog područja služi za otkrivanje manje čestih alela u oboljelih, u kojih mutacije nisu otkrivene prethodnim testiranjem. Cilj ovog istraživanja je bio evaluirati metodu višestrukog umnažanja vezanih sondi, MLPA (engl. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifi cation) ispitivanjem 30-ero osoba s klasičnim KAH-om u Klinici za dječje bolesti Zagreb. Te su osobe bile prethodno ispitane alel-specifi čnim PCR-om na osam najčešćih točkastih mutacija, a ako točkaste mutacije nisu nađene, uz pomoć Southern blot analize ili PCR-a ispitivale su se delecije i konverzije na CYP21A2 i CYP21A1P lokusu.Metode: Analiza MLPA obavljena je primjenom kompleta sondi SALSA MLPA P050 CAH koji sadrži sonde za gen CYP21A2, za pseudogen CYP21A1P te sonde za gene TNXB i ATF6B radi preciznijeg određivanja delecije gena CYP21A2. Među CYP21A2- -specifi čnim sondama su one koje su osjetljive na česte mutacije u egzonima 1, 3, 4, 6 i 7 i intronu 2. Rezultati: Ovom metodom analize otkriva se većina rearanžmana (delecija, duplikacija i konverzija) te gore navedenih malih (točkastih) mutacija gena CYP21A2. U 20-ero bolesnika rezultati su bili u skladu s rezultatima prethodnih testiranja, a u njih 10-ero rezultati su se djelomično slagali s ranijim testiranjima. Nesklad je bio prisutan u nekim konverzijama, delecijama pseudogena i promjenama u intronu 2 gena CYP21A2. Nejasne rezultate potrebno je razjasniti sekvenciranjem gena CYP21A2 i CYP21A1P. Zaključak: MLPA se pokazao kao brza i učinkovita metoda probira čestih mutacija gena CYP21A2 u oboljelih od klasičnog oblika 21-OHD KAH-a. Analiza mutacija među bolesnicima i članovima njihovih obitelji pruža mogućnost pouzdanijeg prekoncepcijskog savjetovanja, prenatalne dijagnostike i terapije KAH-a.

21 hydroxylase deficiency; Molecular diagnostic; Multiple ligation probe ampflication

nije evidentirano