hrvatski

Heterologna ekspresija, pročišćavanje i karakterizacija proteina iz genomske okoline aminokiselina:[protein-nosač]-ligaze i protein- nosača iz Agrobacterium fabrum C58

Aminokiselina:[protein-nosač]-ligaze (aa:CP- ligaze) su novootkrivena porodica ligaza koje aktiviraju određene aminokiseline te ih prenose na njima pripadni protein-nosač (CP, engl. carrier protein). U velikom broju vrsta alfaproteobakterija i betaproteobakterija koje sadrže gene za aa:CP-ligazu i pripadni CP očuvana su još tri dosad neokarakterizirana gena, gen acdB koji kodira acil-CoA- dehidrogenazu, gen koji kodira protein očuvane ali nepoznate strukture i funkcije, anotiran kao Duf1839 (engl. domain of unknown function, dufD) te gen glhE koji kodira glikozil- hidrolazu tipa 2. Pretpostavljeno je da AcdB katalizira oksidativnu deaminaciju aminokiseline vezane na CP nakon čega DufD katalizira kondenzaciju nastalog produkta s monosaharidom, dok GlhE osigurava monosaharidni supstrat za DufD razgradnjom polisaharida. U svrhu karakterizacije navedenih proteina iz organizma Agrobacterium fabrum C58, AcdB i DufD heterologno su eksprimirani u bakteriji Escherichia coli BL21(DE3) te pročišćeni pomoću afinitetne kromatografije na glutation-sefarozi 4B, dok je GlhE eksprimiran u soju bakterije E. coli NiCo21(DE3) i pročišćen afinitetnom kromatografijom na Ni2+-NTA agarozi i hitinskoj smoli. GlhE hidrolizira orto-nitrofenil-beta- galaktozid (ONPG) i laktozu, što ukazuje da je GlhE beta-galaktozidaza. Optimalni pH enzima GlhE je pri pH=8, 0. Kinetički parametri GlhE za ONPG kao supstrat su: Km=1, 16 mmol dm-3, Vm= 0, 285 mikromol dm-3 s-1, kcat=1, 72 x 105 s-1 i kcat/Km =1, 48 x 105 mmol-1 dm3 s-1. Također je pokazano da u otopini GlhE formira tetramere. Eksperimenti su pokazali da AcdB ne veže flavin-adenin- dinukleotid (FAD), a ispitivanja njegove aktivnosti nisu dala rezultate koji bi potvrdili danu hipotezu. Noviji rezultati upućuju da bi AcdB mogao djelovati kao monooksigenaza ovisna o FMN- reduktazi.

afinitetna kromatografija; acil-CoA-dehidrogenaza; beta-galaktozidaza; glikozil-hidrolaza tipa 2; monooksigenaza

nije evidentirano